一、材料准备
1. 靶细胞制备
(1)取传代培养24~28小时对数生长期的YAC-1细胞,用RPMI-1640培养液洗涤2次1000 r/min 离心5分钟。
(2)10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞,并用0.5%台盼蓝染色检测细胞存活大于95%,调整细胞浓度至1×105/ ml。 2. 效应细胞制备
(1)将小鼠颈椎脱位处死,用酒精棉球消毒腹部,剪开腹部皮肤和腹膜,无菌取脾脏,出去脂肪膜等,放入加有约5 ml PBS液的平皿中,用5 ml 注射器抽取平皿内液体缓缓注入脾脏内,将脾细胞冲洗出来。
(2)如此反复冲洗,直到脾脏变白为止(约冲洗5~6次),将细胞移入离心管内,离心洗1次,1000 r/min 离心5~10分钟,重复洗1次,用10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞,计数细胞,并调细胞浓度至1×107 /ml。
二、操作步骤
1. 孵育:取效应细胞和靶细胞各0.1 ml(E:T=100:1)加入细胞培养板中,设3复孔,同时设靶细胞自然释放孔(0.1 ml 靶细胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI-1640培养液)和最大释放孔(0.1 ml 靶细胞+0.1 ml1%NP40液),1000 r/min,低速离心2分钟。置37℃,5%CO2孵育2小时。1000 r/min,离心5分钟。
2. 测定:吸取各孔上清0.1 ml 加至新96孔板中,37℃,10分钟。每孔再加入0.1 ml 新配制的LDH底物溶液,室温避光反应10~15分钟。加入30 µl 1 mol/L 枸橼酸终止液终止酶促反映。酶联监测仪在570 nm波长下读各孔A值。
3. 计算:根据下列公式计算NK细胞活性 展 |