1. 用过氧化物酶，蛋白酶K和DNA酶预处理载玻片。
2. 配置如下一步反应体系（总体积100 μl）
（1）0.5 μl 100 μmol/l 正向引物（终浓度0.5 μmol/l）
（2）0.5 μl 100 μmol/l 反向引物（终浓度0.5 μmol/l）
（3）6 μl 3 mmol/l 4dNTP混合物（终浓度0.12 mmol/l）
（4）2 μl 10 mmol/l MnCl2（终浓度0.2 mmol/l）
（5）10 μl 25 mmol/l MgCl2（终浓度2.5 mmol/l）
（6）2 μl 10×rTth 转录缓冲液（终浓度0.2×）
（7）8 μl 10×螯合缓冲液（终浓度0.8×）
（8）10 μl 1.7 mg/ml BSA（终浓度0.17 mg/ml）
（9）2 μl 2.5 U/ml rTth DNA聚合酶（终浓度9.05 U/ml）
（10）29 μl DEPC处理过的水
3. 用20 μl 吸头加8 μl（如用3孔载玻片）或12~20 μl （如用单孔载玻片）原位PCR扩增体系于各孔上，该液体覆盖整个孔表面。
4. 放20 mm×60 mm 盖玻片于每一载玻片上，小心用指甲油封住盖玻片边缘。 5. 在92℃加热块上，温育玻片90 s。然后转至热循环仪。
6. 用步骤2所配一步反应体系代替原位PCR反应体系。
7. 按如下温度循环程序进行反转录：
（1）1个循环：15 min，70℃
（2）3 min，92℃
（3）15 min，70℃
（4）3 min，92℃
（5）15 min，70℃
8. 按如下温度循环程序进行原位PCR：
（1）29个循环：1 min，93℃（变性）
（2）1 min，53℃（退火）
（3）1 min，72℃（延伸）
（4）最后一步：不定，4℃（维持）
9. 由热循环仪上取下载玻片，浸于100%乙醇中≥5 min 溶解指甲油，用剃须刀或其他小刀橇开盖玻片，刮去残留的指甲油，以便在杂交/检测步骤中能平放上新的盖玻片。
10. 在92℃加热块上温育玻片1 min，然后于室温下用2×SSC浸泡5 min。玻片在4℃可存敢2~3周。
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