今天，百萤为大家带来的是用于细胞和组织中低丰度靶标的高分辨率成像技术。TSA/PSA是一种成熟的细胞信号放大技术，当TSA/PSA与我们光稳定性、水溶性卓越的iFluor染料结合后，产生的荧光信号具有比传统免疫组织化学、免疫细胞化学和免疫荧光方法产生的信号更高的精确度和灵敏度。PSA是美国AAT Bioquest自主研发的与TSA功能类似的信号放大方法，其荧光信号强度比广泛使用的tyramide（TSA）试剂高10-50倍。感兴趣的朋友一起来看看吧！
TSA/PSA原理
酪胺信号放大（TSA）是一种基于辣根过氧化酶（HRP）的催化活性对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。原理为酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（已标记荧光的酪胺在HRP催化H₂O₂下形成共价键结合位点）产生的大量酶促产物与目标蛋白的酪氨酸残基共价结合，从而使目标蛋白标记上特异的荧光或生物素。
图1.TSA/PSA原理及工作流程图。通过类似于传统ICC和IHC方法的工作流程，TSA/PSA试剂可以通过几个简单的步骤实现对所需目标的灵敏检测。
表1.TSA/PSA技术与传统免疫荧光对比
| TSA/PSA多标免疫荧光 | 传统免疫荧光 | |
| 靶点数目 | 不受限制（最多可同时染色7-10种） | 一般标记3种（含DAPI）,>3种标记难度较大 |
| 一抗种类 | 同一种属的不同抗体即可满足要求 | 不同种属的不同抗体 |
| 二抗种类 | 连接辣根过氧化物酶的同种属二抗 | 连接荧光探针的不同种属二抗 |
| 染色策略 | 任何样本无需任何染色策略，简单的重复前一步的染色过程，样本/靶点的差异不影响染色过程，使用简单方便 | 样本抗原的空间位置的差异，需要设计复杂的染色策略。样本/靶点的差异导致染色策略的差异，染色过程复杂、多变 |
| 染色效果 | 高染色分辨率和染色特异性，信号强度更强,更稳定,淬灭时间更长，无背景影响，各靶点的信噪比大大提高，尤其适合组织基于单细胞的定量分析 | 亮度较弱,容易淬灭,各种抗体间存在互相影响，背景较高，对基于单细胞的定量分析不利。 |
| 实验成本 |
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| 应用范围 | 二抗具备通用性，因此实验室中所有的研究领域均可使用 | 二抗不具备通用性，实验室中应用领域受到局限 |
TSA/PSA特点
| TSA | PSA |
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1.适用广，多色标记 2.多重标记可避免抗体种属交叉问题 3.染色特异性好，信号强度高，适合低丰度靶标 4.石蜡切片样本荧光染色背景干净 |
1.检测灵敏度提高了100多倍，比标准IHC，ICC，IF方法高出100倍 2.改进的荧光信号比酪胺（TSA）试剂高10至50倍 3.PSA 自由基的更高反应性允许在HRP-靶相互作用位点更快速，有效和更稳定地标记Styramide缀合物。 4.在不牺牲灵敏度的情况下，PSA可以使用更少量的抗体/探针 |
实验结果展示
图2.分别用iFluor 488 PSA和Alexa Fluor 488 TSA染色甲醛固定的石蜡包埋人肺腺癌阳性组织的染色结果图。人肺腺癌阳性组织切片用兔抗EpCam抗体染色，然后用polyHRP标记的山羊抗兔IgG二抗孵育，最后使用iFluor 488 PSA （Cat#45020）和Alexa Fluor 488 TSA分别染色。图像显示iFluor 488 PSA与Alexa Fluor 488 TSA相比提高了荧光IHC的灵敏度。
图3.分别用iFluor 488 酪胺和Alexa Fluor 488 酪胺染色甲醛固定的石蜡包埋人肺腺癌阳性组织的染色结果图。人肺腺癌阳性组织切片用兔抗EpCam抗体染色，然后用HRP标记的山羊抗兔IgG二抗孵育。显影：iFluor 488 酪胺（左）；Alexa Fluor 488 酪胺（右）。核染色：DAPI
图4.Styramide 超级信号放大试剂盒的信号强度对比。 （A）将HeLa细胞固定，透化并用各种浓度的兔抗微管蛋白一抗标记，建议的稀释浓度为：1：500。 然后将细胞直接与AlexaFluor488缀合的山羊抗兔IgG二抗染色，最后分别与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、AlexaFluor 488酪胺和iFluor 488 Styramide（#45205）染色。 使用FITC滤光片组拍摄荧光图像，并以相同的曝光时间进行分析。 （B）测量相对荧光信号强度，并比较不同检测方法之间的强度。
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