报告基因实验——荧光蛋白（FP) 的显微检测

落射荧光显微镜汞灯

表达突光蛋白的材料一般首先用落射荧光显微镜（epi-fluorescent  microscopy) 来观察 ，尤其当研究表皮上表达的荧光蛋白或者用反褶积软件去掉从焦点之外采集的荧光时[18]。然而，对于较厚的材料，必须使用共聚焦显微镜，因为它可以穿过产生荧光的样品，深入材料 50 um 或更厚的地方，从而产生很薄的（0.5~1.5 um ) 光切片。此外 ，如果对多种荧光蛋白成像，共聚焦显微镜也十分有用，它可以同时检测多种发射波长（参见注释 3 4 )。共聚焦显微镜的主要缺点是使用激光照射样品，因为通常可用的激光激发波长范围有限，所以激发波长必然会与激发效率相冲突，而激发效率取决于发色团的物理特性，虽然只需要 25% 的激发效率，但是 80% 或者更高的效率更合适。

正确选择滤光片非常重要（见注 35 ) ，不管使用哪种显微镜，次优的滤光片都会导致所观察到的荧光蛋白亮度明显降低；相反，它需要增加曝光的时间和光照强度。这不仅影响了荧光蛋白的光稳定性，所有的荧光蛋白会很快被漂白，而且也会影响到细胞的活性。各公司出售不同的滤光片组件，作为一系列显微镜的配件，因为要选择最适合的滤光片，以符合特定荧光蛋白变体的要求，当然，最理想的是配备各种不同的滤光片组件 [16,  55]。

荧光蛋白用作报告基因时，应当注意细胞的一系列代谢物和结构组分发出自身荧光的问题，这种荧光一般被称为自发荧光。由于自发突光谱很广，常常包含了大部分可见光，所以不可避免地会与 GFP，以及其他荧光蛋白的发射光谱相重叠。在植物材料中，自发荧光最主要的来源是叶绿素、多酸类、木质素、纤维素和液泡组分，但是培养基和一些固定方法会产生高强度干扰性自发荧光。精心地选取特定荧光蛋白变体和滤光片，可以减少观察个别组织时遇到的各种麻烦（见注 36 ) , 此外，当表达量很低，且研究入员经验不足时，很重要的一点是将转基因与非转基因材料对比观察。

为了提高荧光蛋白的检测效果，许多实验室构建载体将荧光蛋白用于亚细胞定位，其好处是将信号集中在低水平扩散的荧光背景，产生可清晰观察的图像。这种模式与低水平扩散的荧光截然相反，就样品的自发荧光而言，荧光蛋白的光谱特性并未有多大区别（见注 37 )。

另一种增强 FP 检测效果的方法是遗传级联效应。FP 与其他报告基因的不同在于其检测过程中没有建立酶的级联放大效应，这就意味着该检测方法比 GUS 或者 LUC 的检测敏感性更低。所研究的启动子与反式激话蛋白如 ga14 : vp16 相融合，荧光蛋白受顺式元件控制，反式激活蛋白又与顺式元件结合，这样便提供了级联效应的一种方法[43]。

图 3.1 (c ) 显示的是发芽中的小麦种子，它源于稳定导入了水稻「 actin 启动子-GFP」载体的转基因植株。GFP 是 sGFP  S65T 变体，图像在莱卡 MZF1MZH Ⅲ 型荧光立体显微镜下拍摄，该显微镜安装了莱卡 DFC300FX 数码相机，并配备莱卡 GFP2 型滤光片(见注 42) 。

(1) 首先用落射荧光显微镜观察材料。

(2) 打开汞灯（见注 38) ，首先检查光阑是否在原位。

(3) 将活体组织（整体包埋或切片的材料）置于载物台上（见注 39~42) 。

(4) 用透射光聚焦显微镜。

(5) 选择滤光片（见注 43 ) , 移开汞灯光阑，观察样品（见注 44)。

(6) 根据需要捕捉图像（见注 45）。

(7) 如果需要的话，可以使用共聚焦显微镜观察材料（见注 46)。