基本方案5 直接注射重组体病毒载体至小鼠脑内

消毒纸巾小鼠脑图谱手术用具汉密尔顿注射器术后恢复笼

1.麻醉成年鼠，准备手术。在头盖骨上钻洞。注射的病毒可以在脑中扩散3~4 mm。

2.4 min后用5ul 汉密尔顿注射器缓慢注射 2~4ul 重组体病毒悬液至目标区域。当注射. 元成后，将针头抬起1 mm，静置2 min，1 min内收针。

在作者的实验室，腺病毒的滴定量是109到1011病毒颗粒/ml，腺相关病毒为1011病毒颗粒/ml，HIV或MoMuLV是109病毒颗粒/ml。

3.如果多于两个注射点，重复第5~6步。每个鼠注射量不要大于10ul。

4.将小鼠从脑功能区定位支架下移开，清洗头盖骨，在伤口上面盖灭菌纸巾。将皮肤盖拢，用伤口夹夹好皮肤切口，将小鼠转移至恢复笼。

支持方案 基因修正细胞的准备

成纤维细胞

la.在75 cm2的培养瓶或者l0 cm的培养皿用DMEM/10%FBS培养成纤维细胞直至细胞生长至80%~90% 汇合度。不要用静止期的细胞因为这些细胞移人脑后很难成活。

2a.洗细胞两遍，每次用10ml的PBS。加入1~2 ml的ATV胰酶到培养瓶中并在室温赙育2~3 min。拍打瓶子使细胞消化下来。

3a.用8~9 ml的DMEM/10%FBS 重悬细胞，将其移入15 ml离心管中，1000g室温离心3 min。倒掉上清。用1ml的D-PBS重选细胞，用Iml的习惯吹打混匀。加4 ml的 DPBS 并洗细胞2次，1000g 离心3 mm。在最后一次离心之前，计数细胞。0.4 ml D-PBS重悬细胞，转移至0.5 ml的离心管中，2000 g离心1 min。

4a.倒掉上清并用EHPBS重悬成纤维细胞，制成 50000~100000个细胞/ul的细胞悬液。置于室温或者冰上。3h 内移植细胞。

神经祖细胞

1b.在75 cm2的培养瓶或者 10cm 的培养皿用DMEM/F12/FGF培养神经祖细胞直至细胞生长至80%~90% 汇合度。

2b.去除培养基，加人1~2 ml 的ATV胰酶到培养瓶中并拍打瓶子使细胞消化下来。

3b.用8~9 ml的 DMEM/F12/FGF重悬细胞，将其移入15 ml离心管中，1000g室温离心3 min。倒掉上清。用Iml的D-PBS重选细胞，用Iml的习惯吹打混勻。加入4 ml的DPBS并洗细胞两次，1000g离心3 mm。在最后一次离心之前，血细胞计数器计数细胞30.4 ml D-PBS重悬细胞，转移至0.5 ml的离心管中，2000 g离心lmin。

4b.倒掉上清并用含有20ng/ml FGF-2的D-PBS重悬神经祖细胞，制成50000 个细胞/ul 的细胞悬液。置于室温或者冰上。3 h内移植细胞。