实验概要
PrimeScript RT Reagent Kit反转录实验
主要试剂
PrimeScript RT Reagent Kit(Takara)
主要设备
PCR仪(Roche)
实验步骤
实验前准备
提前打开制冰机
反转录反应【SYBR® Green分析法】
按表1组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行)。为了保证反应液配制的准确性,减少分装时造成的误差,应按照比实际用量稍大的体积配制反应液,最后加入 RNA样品。
表1 | ||
试剂 | 使用量 | 终浓度 |
5×PrimeScript Buffer(for Real Time) | 4 μl | 1× |
PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1 μl | |
Oligo dT Primer(50 μM) | 1 μl | 25 pmol |
Random 6 mers(100 μM) | 1 μl | 50 pmol |
Total RNA/对照样本 | X ul | |
RNase Free dH2O | up to 20 μl |
反转录反应条件如表2
表1 | |||
步骤 | 条件 | 时间 | 循环数 |
1 | 37℃ | 15min(反转录反应) | 1 |
2 | 85℃ | 5s(酶失活反应) | 1 |
3 | 4℃ | 保持 | 1 |
cDNA PCR反应
cDNA PCR之前,上述各样本中加入RNase H,去除RNA模板,取适量cDNA进行普通PCR,所用引物见表3,其中β Tubulin内参引物参考文献,PCR条件如下见表4。
表3 | ||
引物名称 | 序列(5’> 3’) | 长度 |
FR cDNA F | AGGACAGACATGGCTCAGCGGA | 396bp |
FR cDNA R | TACCCGCTCTTTGCGCCAGC | |
β Tubulin cDNA F | AATCCCCACCTTTTCTTACTCC | 121bp |
β Tubulin cDNA R | AAAGATGGAGGAGGTTCCC |
表4 | |||
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
1 | 95 | 2min | 1 |
2 | 94 | 45s | 35 |
3 | 56/Tm-3 | 30s | |
4 | 72 | 45s | |
5 | 72 | 10min | 1 |
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