实验概要

小鼠成纤维细胞向神经干细胞的定向转分化

主要试剂

• 无菌水、DPBS、0.1%明胶、NSC M、0.05%胰蛋白酶胰蛋白酶、0.1 g/mL明胶、细胞基础培养基、PDL、神经干细胞培养液、Polybrene、PDL、laminin
  

主要设备

35 mm培养皿、四孔板(UNIC)、移液枪、口吸管、玻璃管

实验材料

小鼠成纤维细胞
携带有目的基因的逆转录病毒（滴度大于10⁸）：pMX-cMYC、pMX-KLF4。这些质粒来源于addgene公司，质粒的详细信息可从公司网站获得。质粒扩增和提取的具体原理和步骤可见《分子克隆实验指南》。pQCX-S0X2、pQCX-PAX6、pQCX-NGN2、pQCX-ID1、pQCX-ASCL1、pQCX-BRN2、pQCX-HES1。这些质粒来源于clonetech公司，质粒的详细信息可从公司网站获得。质粒扩增和提取的具体原理和步骤可见《分子克隆实验指南》。使用前于-80℃保存。

实验步骤

（1）在35 mm培养皿中加入1mL0.1g/mL的明胶，37℃、5%CO2培养箱中静置1h。
（2）弃去1h前包被皿的明胶，将小鼠成纤维细胞以0.05%胰蛋白酶胰蛋白酶消化3 min，以等体积的成纤维细胞培养液终止，室温200g离心5min，用成纤维细胞培养液重悬，按2×10⁵每35 mm培养皿的密度接种于弃去明胶的皿中。
（3）接种后24 h，于成纤维细胞培养液中按终浓度4~8μg/mL加入polybrene，并在每2.5mL液体中加入9种病毒各10μL，充分混匀。
（4）弃去成纤维细胞培养皿中的培养液，每皿中加入2.5mL的病毒混悬液，37℃、5%CO2培养箱中静置24 h。
（5）弃去病毒混悬液，每皿加入2mL细胞基础培养基。
（6）24 h后，为提高感染效率，重复感染一次。
（8）第二次感染结束后，将感染了病毒的细胞消化传代，用NSC M重悬，按2×10⁵每35 mm培养皿的密度接种于提前包被了PDL和laminin的皿中。
（9）每日更换NSC M并观察。待出现了神经干细胞克隆并长至足够大小后（图5-5）用口吸管和玻璃管挑取克隆至提前铺有PDL和laminin的四孔板中培养扩增，每孔放置一个克隆，培养液为NSC M。