大肠杆菌电转化感受态细胞制备流程及转化方法

实验概要

大肠杆菌电转化感受态细胞制备流程及转化方法

实验步骤

第一天：

1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养

2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用

3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用

第二天：

4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升摇瓶

5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时

6. 定时监控OD600值(培养1小时后每半小时测定一次)

7. 当OD600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)

8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)

9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。

10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液

11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞

12. 离心，弃上清液

13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞

14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)

15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml

16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存

转化方法：

1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA，冰上培育约5分钟

2. 添加1-3μl DNA，冰上培育约5分钟

3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中

4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT

5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆， 25μFd，2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上)

6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中

7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原

8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养