实验概要
本文介绍了唾液淀粉酶活性观察的原理及方法步骤等。
实验原理
酶是指化学本质为蛋白质的生物催化剂。在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即称为酶活性(酶活力)。影响酶活性的因素是多方面的，如温度、PH及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。在一定条件下，能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度，而能使酶活性达到最高时的PH即酶的最适PH。例如，唾液淀粉酶的最适温度是37℃，而其最适PH是6.8。能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性而丧失活性。
酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。
本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况。唾液中含有唾液淀粉酶。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈颜色反应，如图所示：
主要试剂
1. 0.5%(W/V)淀粉溶液：称取0.5g可溶性淀粉，加少量预冷的蒸馏水，在研钵中调成糊状，再徐徐倒入约90ml沸水，同时不断搅拌，最后加水定容为100ml即成。要求新鲜配制。
2. 稀碘溶液：称取1.2g I2、2g KI，加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至200ml。保存于棕色瓶中，用前5倍稀释。
3. 不同PH溶液：
A液—0.2mol/L Na2HPO4溶液：称取35.62g Na2HPO4·12H2O，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml。
B—0.1mol/L柠檬酸溶液：称取19.212g无水柠檬酸，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml。
1) PH5.0缓冲液——取A液10.3ml、B液9.7ml混合而成。
2) PH6.8缓冲液——取A液14.55ml、B液5.45ml混合而成。
3) PH8.0缓冲液——取A液19.45ml、B液0.55ml混合而成。
4. 0.5%(w/v)蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，将之溶于蒸馏水后定容至100ml。
5. 斑氏试剂：
A液—称取无水CuSO417.4g，将之溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后用蒸馏水稀释至150ml。
B液—称取柠檬酸钠173g、Na2CO3100g，再加蒸馏水600ml，加热溶解后冷却，用蒸馏水稀释至850ml。
将A液与B液混合即得斑氏试剂。
6. 1%(w/v)NaCl溶液：称取NaCl 1g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100ml。
7. 1%(w/v)CuSO4溶液：称取无水CuSO4 1g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100ml。
主要设备
1. 白瓷板(或比色板)
2. 恒温水浴锅
3. 电炉
实验步骤
1．唾液淀粉酶应用液的制备
1) 每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。
2) 先用蒸馏水漱口，将口腔内的食物残渣清除干净。
3) 口含约20ml蒸馏水，做咀嚼动作1~2min，以分泌较多的唾液。然后将口腔中的唾液吐入一个干净的小烧杯中。
4) 取一块干净的白瓷板，按下表操作：
穴号 试剂(滴) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
蒸馏水(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 弃去 |
唾液[注2](滴) | 2→ | 2→ | 2→ | 2→ | 2→ | 2→ | |
0.5%淀粉溶液(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | |
碘液[注3](滴) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
观察结果(颜色)，以呈棕红色者浓度为准，稀释原唾液作应用液。
2．温度对酶活性的影响
1) 取3支试管，按下表进行实验。
试管编号 | 1 | 2 | 3 |
0.5%淀粉(ml) | 5 | 5 | 5 |
PH6.8缓冲液(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
稀释唾液(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
不同温度(℃) | 置冰水浴中 | 置37℃水浴中 | 置沸水浴中 |
将各管中的试剂加好后混匀，然后及时在上述温度下分别进行处理。
2) 在干净的比色板上，于各孔穴中分别滴加2滴碘液。
3) 每隔1min从第2支试管中取反应液1滴，与比色板孔穴中的碘液混合，观察颜色的变化。
4) 待第2支试管中的反应液与比色板孔穴的碘液混合后颜色不再变化时，取出试管，并将在沸水浴中处理的试管用冷水冷却，然后向各试管中滴加碘液1~3滴。
摇匀后观察并记录各管颜色，比较管中淀粉水解的程度，说明温度对酶活性的影响。
3．PH对酶活性的影响
1) 取3支试管，按下表编号进行实验。
管号 | 1 | 2 | 3 | |
0.5%淀粉(ml) | 2 | 2 | 2 | |
不同PH的缓冲液(ml) | PH5.0 PH6.8 PH8.0 | 2 | — | — |
— | 2 | — | ||
— | — | 2 | ||
稀释唾液(滴) | 10 | 10 | 10 | |
摇匀后，将各管置于37℃水浴中处理。
2) 每隔1min从PH6.8的试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴，观察其颜色变化。
3) 待颜色呈棕色时，向各管中加稀释碘液1~3滴。观察各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，解释PH对酶活性的影响。
4．酶反应的特异性
1) 取2支试管，按下表编号后进行实验。
试管号 | 1 | 2 |
0.5%淀粉(ml) | 2 | — |
0.5%蔗糖(ml) | — | 2 |
稀释唾液(ml) | 1 | 1 |
2) 摇匀后，将各管置于37℃水浴中处理10min。
3) 取出试管，分别加入斑氏试剂2ml，混匀。
4) 将各管置于沸水浴中煮沸2~5min。观察并解释结果。
5．激活剂与抑制剂对酶活性的影响
1) 取3支试管，按下表编号后进行实验。
管号 | 1 | 2 | 3 |
0.5%淀粉(ml) | 3 | 3 | 3 |
PH6.8缓冲液(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
1%NaCl溶液(ml) | — | 1 | — |
1%CuSO4溶液(ml) | — | — | 1 |
蒸馏水(ml) | 1 | — | — |
稀释唾液(ml) | 1 | 1 | 1 |
2) 将各管摇匀后，一起放入37℃水浴中保温。
3) 每隔1min从第1支试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴于此滴反应液中，观察其颜色变化。
4) 待加碘后颜色呈棕色时，取出3支试管，分别加入稀碘液1~3滴。观察、比较各管颜色的深浅，并解释之。
注意事项
1. 可以根据实际情况，用纱布或滤纸过滤一下收集滤液使用。
2. 加唾液时，只在第1穴中加入2滴新制备的唾液。将之与该穴中的蒸馏水混匀后，取出2滴加入第2穴中。待混匀后又从第2穴中取出2滴加入第3穴。如此继续操作，直到从第6穴中取出2滴弃去。待穴中颜色呈红棕色时，即可照该穴中唾液的稀释度稀释制备的唾液，并用稀释好的唾液进行下面的实验。
3. 在往白磁板的孔穴内依次加完蒸馏水、稀释好唾液并且加完淀粉溶液之后，加入碘液之前，应放置5min。
4. 为确保实验的效果，在加入试剂时宜在冰浴条件下进行，尤其是气温较高的南方地区要注意。
5. 加唾液时应从第1管开始依次进行，前后管之间大约相隔时间5~7s。
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