实验概要
本实验拟通过随机引物及PCR方法,将DNA探针片段用DIG标记,进一步掌握探针的标记技术。
实验原理
带有地高辛标记的dUTP(图1)通过缺口翻译、随机翻译或PCR等反应而使探针核酸片段带有地高辛,进一步可与带有AP、CSP等各种抗地高辛抗体复合物发生免疫反应,使探针上带有AP等分钟,进一步能催化化学或发光反应。图2为各种DIG标记探针及检测类型汇总;图3为DIG标记探针的方法;图5为标记探针应用;图4为DIG标记探针的检测方法。
图1
图2
图3
图4
图5
实验步骤
1. 1ug(10ng <DNA探针量<3ug)待标记DNA溶于16ul水中,在沸水浴10分钟变性,迅速放于冰浴(NaCl或乙醇冰浴)冷却。
2. 在冰浴上,上述管中加入4ulDIG-HIGH-Prime混合物(含5×反应缓冲液、50%甘油、各1mM的dATP,dCTP,dGTP,0.65mM的dTTP及0.35mM的DIG-dUTP ,1U/ulKlenow酶)。
3. 离心混合,3760分钟或过夜
4. 加2ul0.2MEDTA(pH8.0)或65℃10min终止反应。
5. 在上述20/22ul反应体系中加入2.5ul4MliCl,75ul(-20℃预冷)乙醇沉淀,70%乙醇洗沉淀,真空干燥,复溶于少量PH8.0TE中,-20℃保存(忌讳反复冻融)。
附 件 (共5个附件,占128KB)
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