实验概要

本实验方法介绍了miPS建系的详细操作流程。

主要试剂

所用试剂盒：
逆转录病毒体系试剂盒  MIPD0-000-001

慢病毒体系试剂盒      MIPD-000-02

规格：5次           

实验步骤

Day -1：接种 2×10⁴细胞到每个24孔板的孔

Day 0：按MOI为5的病毒量把四个因子的病毒同时加到事先接种好的靶细胞里，同时加8ug/ml polybrene，成纤维细胞培养液不加sp。

Day 1：换液，从今天开始可以加sp的成纤维培养液。

Day 3：换液，观察细胞。

Day 5：换液，观察细胞，并准备饲养层。

Day 6：感染第六天的成纤维细胞这个时候细胞开始聚集在一起。如果感染效率比较高的话会出现小的克隆，此时可以用0.25%胰酶把细胞消化成单细胞接种到饲养层上，接种的密度是2*87.5px，仍然用靶细胞的培养液。

Day 7：弃去成纤维细胞培养液，换成miPS建系培养基。

Day 9：换miPS建系培养基，仔细观察这个时候应该会开始出现小的克隆 。

Day 11 and Day 13：继续换液并观察克隆，这个时候克隆逐渐长大，重编程过程需要更多的营养，这个时候液体颜色容易变化，13d后细胞每天都必须进行换液，如果液体颜色在变黄的话，每个六孔板加3-4ml的液体。

Day  14：这个时候开始准备挑克隆，提前一天准备饲养层，选择用24孔板进行第一次的克隆挑取，一般在挑克隆之前进行小鼠胚胎干细胞特异性的膜蛋白标志PE-SSEA-1的活细胞染色，SSEA-1阳性的克隆是完全重编程的克隆，一般情况是可以进行传代稳定成系的克隆。

Day 15：成纤维种到饲养层后的第七天，饲养层细胞活力逐渐变小，有些开始凋亡，这个时候开始加条件培养液。

Day 17及其以后：挑取克隆后传代及其鉴定。

注意事项

1. 目的细胞的质量要好，细胞代次低，状态好。

2. 所使用病毒滴度要高。

3. 饲养层密度要比平常传代时所使用的饲养层密度要密一点，而且最好选用新鲜的饲养层，而不选择冻存复苏的饲养层，新鲜的饲养层活力较强。

4. 饲养层状态不太好后，要及时换成条件培养液。

5. 出现克隆后，可以进行活细胞染色，进行筛选。

6. 出现克隆后，要及时的挑出来，否则越养克隆状态越差。