实验概要
本实验制备了酵母转化质粒,快速从转化酵母菌中分离了用于Southern分析的基因组DNA。
主要试剂
2% Triton X-100,1%SDS,100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl(pH8),1mmol/L Na2EDTA,苯酚:氯仿:已戊醇(25:24:1),YPD培养基,TE缓冲液(pH8),RNase A,无水乙醇,4mol/L醋酸铵
主要设备
1.5ml微型离心管,培养皿,离心机,玻珠,振荡器
实验步骤
1. 酵母转化质粒的制备
1) 在质粒DNA选择性培养基中,置30℃培养少量培养物过夜。
2) 将培养物转入一支1.5ml的微型离心管,离心5秒,收集细胞。
3) 小心倾去上清液,轻弹离心管,使沉淀重新悬浮于残余培养液中。
4) 加入0.2ml的2% Triton X-100,1%SDS,100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl(pH8),1mmol/L Na2EDTA;加入0.2ml的苯酚:氯仿:已戊醇(25:24:1);加入0.3g酸洗过的玻珠。
5) 振荡2分钟。
6) 离心5分钟。
7) 用1~5μl含DNA的水相转化0.2ml的大肠杆菌受体菌,用15μl水相转化酵母菌。
2. 用于Southern分析的基因组DNA分离
1) 用YPD培养基,置30℃培养10ml酵母至最大生长量。
2) 用医用离心机离心2分钟,弃上清液,收集细胞,用0.5ml蒸馏水重新悬浮,将细胞转入1.5ml微型离心管中,离心5秒收集细胞。
3) 重复第二步。
4) 重复第二步。
5) 加0.2ml TE缓冲液(pH8),振荡3~4分钟。
6) 离心5分钟,将水相移至洁净试管,加1ml的无水乙醇,上下倒置,混合均匀。
7) 离心2分钟,弃上清液,悬浮在0.4ml TE缓冲液和3μl的10mg/ml的RNase A溶液,置37℃保温5分钟,加入10μl 4mol/L醋酸铵和1ml的无水乙醇,上下倒置,混匀。
8) 离心2分钟,弃上清液,自然干燥后,用50μl的TE缓冲液悬浮,每份样品用10μl进行Southern印迹分析,每份用量约2~4μg DNA。
方法评论