实验概要
本实验介绍了分别从40ml和5ml酵母培养液中制备酵母DNA的操作流程。
实验步骤
1. 酵母DNA微量制备(40ml)
1) 在125ml三角瓶中用40ml YPD培养液在30℃条件下培养细胞达最大生长量(过夜)。
2) 将上述培养物移入螺盖离心管，用医用离心机或Sorvall SS-34转头以5000r/min离心5分钟，弃去上清液。
3) 将细胞悬浮在3ml的0.9mol/L山梨醇-0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)溶液中。
4) 加0.1ml的2.5mg/ml消解酶100T，置37℃条件保温1小时。
5) 用医用离心机或Sorvall SS-34转头以5000r/min离心5分钟，弃去上清液。
6) 将细胞重新悬浮在5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L醋酸钠溶液中。
7) 加0.5ml的10％十二烷基硫酸钠(SDS)，混匀。
8) 置65℃保温30分钟。
9) 加1.5ml的5mol/L醋酸钾溶液，在冰浴上放置1小时。
10) 用Sorvall SS-34转头以1000r/min离心10分钟。
11) 将上清液转移至干净的塑料离心管中，室温下加入两倍体积的95％乙醇，混匀，以5000～6000r/min离心15分钟。
12) 弃上清液，将沉淀物干燥，然后悬浮在3ml TE缓冲液(pH7.4)中，此操作可能需要几个小时。
13) 用Sorvall SS-34转头以1000r/min离心15分钟，将上清液转移到一个新试管，弃沉淀物。
14) 加入150μl的1mg/ml RNaseA溶液，在37℃下保温30分钟。
15) 加入一倍体积的100％异丙醇，轻轻混匀，取出呈松散纤维状的沉淀物，无需离心，让其自然干燥。
16) 将沉淀物悬浮在0.5ml TE缓冲液(pH7.4)中，置4℃保存。酵母DNA的最终浓度约为200μg/ml。如果最后的溶液混浊不清，用异丙醇再次沉淀DNA或用Sorvall SS-34转头以1000r/min离心15分钟。
2. 酵母DNA微量制备(5ml)
1) 按酵母于5ml YPD中，置30℃培养过夜。
2) 用医用离心机以2000r/min离心5分钟沉淀细胞，弃上清液。
3) 将细胞悬浮在0.5ml的1mol/L山梨醇-0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)缓冲液中，转动一支1.5ml离心管中。
4) 加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液，置37℃保温1小时。
5) 离心1小时。
6) 弃上清液，把细胞悬浮在0.5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na2EDTA溶液。
7) 加0.05ml的10％ SDS，混匀。
8) 置65℃保温混合物30分钟。
9) 加0.2ml的5mol/L醋酸钾，把离心管在冰浴中放置1小时。
10) 离心5分钟。
11) 将上清液转移到一洁净微型离心管，室温下加入等体积的无水异丙醇，混匀，放置5分钟。短暂离心(10秒钟)弃上清液，让沉淀自然干燥。
12) 用0.3ml TE缓冲液(pH7.4)重新悬浮沉淀。
13) 加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液，置37℃保温30分钟。
14) 加0.03ml的3mol/L醋酸钠，混匀，用0.2ml的无水异丙醇沉淀，再短暂离心收集DNA。
15) 弃上清液，自然干燥，用0.1～0.3ml TE缓冲液(pH7.4)重新悬浮DNA。
16) 在使用限制性内切酶酶解DNA之前，有必要将最终浓度溶液离心较长时间(15分钟)以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。
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