实验概要
本说明适用于没有全自动染色机或 capillary gap system（如 Shandon Sequenza）等的实验室。可用移液器人工加试剂，也适用于全自动或半自动系统。
培养箱应配备有加湿器避免组织变干。变干发生在任何阶段最后都会导致非特异性染色及高背景染色。带密封盖的浅塑料盒，底部铺上湿纸巾就是一个加湿装置。玻片只要不贴紧纸巾且平放就不会变干。一个好的解决办法就是将一根塑料输液管切割成若干适合恒温箱的小段，用胶成对地粘到恒温箱底部，每对管之间间隔 4 cm，这样能给玻片一个平稳及升起的小平台，使玻片直接接触湿纸巾。
一抗和二抗的最佳稀释度可以从说明书中获得，或者通过试验获得。根据所获得的结果调节至最佳稀释度。孵育时间要严格遵照说明书的建议。
辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 是酶解法中最为常用的酶。这些酶的底物较多。
实验步骤
1. 第一天
1) 若使用 HRP 标记二抗检测，则需要封闭内源性过氧化物酶，但我们建议在开始一抗孵育前不予理会。
2) 在含 0.025% Triton X-100 的 TBS 中漂洗玻片 2×5 分钟 ，轻轻震荡。
3) 用含 10% 正常血清、1% BSA 的 TBS 室温封闭 2 小时。控干封闭液（不是漂洗），并用纸巾将玻片周围擦干。
4) 一抗用含 1% BSA 的 TBS 稀释后加到玻片上。
5) 4 °C 孵育过夜。
2. 第二天
1) 用含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗 2 X 5 分钟，并轻轻震荡。
2) 若使用 HRP 标记二抗检测，则需将玻片在含 0.3% H2O2 的 TBS 中孵育 15 分钟以封闭内源性过氧化物酶。
3) 酶法检测（HRP 或 AP 标记二抗）：
4) 在 TBS 中漂洗 3 X 5 分钟。
5) 若采用荧光检测，则结束此步后就可以用封固剂和盖玻片进行封固了。
6) 若采用底物显色，则还需继续进行下述操作。
7) 室温下与底物作用 10 分钟。
8) 流水冲洗 5 分钟。
9) 复染（如果需要）。
10) 脱水，擦干并封固。
注意事项
1. 二抗可能会与组织内的内源性免疫球蛋白发生交叉反应。以二抗同种动物来源的正常血清预处理组织，可减少这种作用。加一抗前先与正常血清孵育也可消除 Fc 受体与一抗和二抗结合。抗体稀释缓冲液中的 BSA 能降低疏水作用引起的非特异结合。 如果组织样品经醛类如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等固定后用免疫荧光法 (IF) 检测，在加一抗前要用含 0.3M 甘氨酸的封闭液封闭。因为甘氨酸能结合自由醛基，否则这些醛基会与一抗和二抗结合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定时，有可能由于自由醛基导致高背景。
2. 一抗应稀释到厂家推荐的最佳稀释度或者曾经筛选到的最佳稀释度。如果没有起始稀释倍数，我们建议按下述操作。大多数 IHC-P 抗体的使用浓度在 0.5-10 μg/ml 之间。要确保一抗和被染色的组织来自不同物种。 例如，小鼠组织，一抗来自小鼠，抗鼠 IgG 二抗会与小鼠组织中的所有内源性 IgG 结合，导致高背景染色。将小鼠单克隆抗体用于小鼠组织将在我们小鼠-对-小鼠说明书中讨论。
3. 过夜孵育可以使低亲和力的抗体有较长的时间结合到抗原上。然而，不论抗体亲和力的高低，一旦抗原抗体结合达到饱和或平衡，将不会再发生结合。因此，过夜孵育确保了结合达到平衡。
4. 过氧化氢 (H2O2) 能抑制内源性过氧化物酶活性从而降低背景染色。组织切片至水后，在 DAB（3,3’二氨基邻苯胺底物）溶液中孵育，能检测是否存在内源性过氧化物酶。如果切片在显微镜下出现棕色区域，说明存在过氧化物酶，应该做封闭。由于过氧化氢能修改一部分抗原表位，减少了抗原抗体的结合，因此可在初步孵育切片后再与过氧化氢孵育即可避免此问题。用 TBS 或水稀释过氧化氢。有些实验室用甲醇稀释，甲醇更适合于血涂片或其它富含过氧化物酶的组织如肝脏。甲醇稀释过氧化氢可减少在水溶液中反应时对组织的损坏。对于其它组织，我们建议使用 TBS 或水，因为甲醇/过氧化孵育后会降低一些抗原抗体的结合，特别是对于细胞表面蛋白来说。 内源性过氧化物酶的封闭只用于过氧化物酶标记物如 HRP。
5. 观察组织和细胞形态所用的复染剂通常是苏木精（蓝色）、核固红或甲基绿。采用荧光检测法时，复染用 DAPI（蓝色）或碘化吡/PI（红色）。
6. 切记 DBA 是一种致癌物，操作时要穿上有效的防护服。与次氯酸钠在密封容器中过夜可弱化它的致癌作用（相互作用产生有害气体），再根据实验室操作规程处理。如果使用 AP，取 0.24 mg/ml 的左旋四咪唑加到染料溶液中，可抑制内源性磷酸酶活性，降低背景染色。
7. 如果使用 AEC、固红、INT 或其它水溶性染料，切记它们溶于醇类溶剂，要选用合适的水溶性封片剂。切勿进行步骤 9 中的脱水擦干。
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