实验概要
本实验从含有源自文库筛选的噬菌体克隆制备了噬菌体上清液，通过噬菌体ELISA，评估筛选出DNA/RNA结合区域的特异性序列的结合活性。
实验步骤
1. 噬菌体的制备
1) 挑取含有源自文库筛选的噬菌体克隆的单菌落。用灭菌牙签挑取单菌落接种于灭菌圆底培养板的微孔内，其中加有150ul含15ug/ml的四环素的2×TY培养基。用一个微孔培养展示野生型DNA/RNA结合区域的噬菌体，作为阳性对照。以250r/min的速度小心振荡微孔板，30℃培养16小时。
2) 在合适的吊斗式离心机中3700g离心96孔培养板15分钟，以制备噬菌体上清液。将上清液转移到一个新的微孔板内，4℃保存。
2. 噬菌体ELISA
1) 将生物素联结的核酸靶标位点(通常是0～5pmol之间，稀释于50ul PBS缓冲液中)加入链亲和素包被的微孔板内。对于阳性对照，将适量的野生型结合位点加入一个微孔内。用一个只含PBS缓冲液的微孔作为阴性对照，以测定ELISA的本底。将微孔板于20℃放置15分钟。
2) 每孔加入150ul含有4％(w/v)脱脂牛奶的PBS缓冲液作为封闭剂。将微孔板于20℃放置1小时。
3) 将噬菌体上清液(得自步骤1.2)1:10稀释于lml含有2％(w/v)脱脂牛奶、1％(体积分数)Tween-20及20ug/ml的超声破碎的鲑鱼精DNA的PBS缓冲液中。
4) 将核酸包被的微孔中的封闭液弃去，加入50ul稀释过的噬茵体上清液。将微孔板于20℃放置l小时。
5) 将结合液弃去，用200ul含1％(体积分数)Tween-20的PBS缓冲液洗涤7次，再用PBS缓冲液单独洗涤3次。
6) 将HRP联结的抗M131gG抗体用含有2％(w/v)脱脂牛奶的PBS缓冲液作l:5000稀释，然后每孔加入50u1。20℃放置l小时。
7) 将抗体结合液弃去，用200ul含0.05％(体积分数)Tween-20的PBS缓冲液洗涤3次，再用PBS缓冲液单独洗涤3次。
8) 加入100ul HRP底物液，如上文所述的基于TMB的显色液，使ELISA显色。约5分钟后终止显色反应，如使用TMB，则加入100ul 1 mol/L的硫酸。立即用酶标仪测定ELISA数值。
9) 要评估筛选出的结合区域的特异性序列的结合性，将它们的ELISA数值与阳性对照孔和阴性对照孔的数值进行比较。
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