白细胞介素2的制备及鉴定实验

实验概要

本实验制备了白细胞介素2(IL2)，并进行了鉴定实验。IL2是Th细胞受有丝分裂原或特异性抗原刺激后，并在白细胞介素1的辅助下，产生的一种可溶性糖蛋白。IL2是体内重要的广谱免疫增强因子，临床上常用于治疗免疫缺陷病及肿瘤等。

实验步骤

1. 制备粗制IL2无菌采血，肝素抗凝，用RPMI1640按1:1将血液稀释，然后重层于菲可液面上，以1 500r/min离心30min，取白细胞层，用RPMI1640洗2次，按1～3×10⁶细胞/ml浓度加入10%胎牛血清RPMI1640，注入一装有磁棒的大瓶中，置37℃搅拌培养4天，取出，分装于50ml离心管中，1 500r/min离心20min，弃上清液，将细胞悬浮于1%胎牛血清RPMI1640培养液中，使细胞浓度为10⁶细胞/ml。同时加入纯质PHA1～2μg/ml以及多种B淋巴母细胞株，使其浓度为10⁶细胞/ml，37℃搅拌培养18～24h后，取出以1 500r/min离心30min，取上清，用0.45μm滤膜过滤除菌，滤液即为粗制IL2。

2. 制备精品IL2

   1) 硫酸铵沉淀与真空浓缩透析：在4℃下将硫酸铵粉末按50%饱和量加入上述粗制IL2中，搅拌2h，12 000g离心30min，取上清液，再加入80%饱和硫酸铵，4℃过夜，次日以12 000g离心30min，弃上清液，将沉淀溶于01% PEG 6 000的1:2 PBS溶液(pH值73)中，置真空负压浓缩透析器中透析浓缩至所需容量。

   2) Sephadex G100凝胶过滤：用2×18cm的过滤柱及PBS(同上)，以80ml/h流速过滤。将各管洗脱液用紫外分光光度计280nm检测其OD值。同时将几种不同分子量的标准蛋白也用相同条件过滤及检测其OD值，绘出IL2及标准蛋白OD值的曲线。将各管洗脱液过滤除菌后，作白细胞生物活性试验，按试验结果绘出曲线，找出具有最高IL2活性的几管洗脱液，混合后，作下一步精制。

   3) BlueSepharose层析：将上述混合后的洗脱液加入BlueSepharose柱中，流速约15ml/h，按每管10ml收集流出液，当样品全部流出柱中以后，用上述PBS洗涤样品柱，再用梯度NaCl溶液(从0.075mol/L至0.6mol/L NaCl的PBS溶液)洗脱，按2ml/管收集洗脱液。NaCl 溶液梯度及流速均由梯度混合器调节控制。洗脱完毕后，作各管OD值及NaCl浓度的测定。各管洗脱液过滤除菌后，作出生物活性测定。将峰值前后的数管洗脱液混合，即为精制的IL2。置-20℃冰箱保存。

3. 检定

   1) 活性测定用10%胎牛血清RPMI1640将上述IL2稀释为50%、25%、125%、625%，而后再将每个百分浓度以及100%浓度的IL2倍比稀释，自1:2至1:128，将每个稀释度分别加入多孔板的孔中，每孔0.1ml。然后取CT6细胞株(小鼠的IL2依赖性T细胞株)，调整浓度为10⁶细胞/ml，每孔加入0.1ml，同时用培养基代替IL2作对照。将多孔板培养24h后，取出按每孔1μM的浓度加H³标记胸腺嘧啶核苷继续培养4h。取出后用MESHⅡ细胞收集器过滤洗涤细胞，用β计数器测定各孔细胞的cpm。必要时按此结果绘出曲线，确定活性单位。

   2) 蛋白含量测定采用分光光度计，分别测得OD280及OD260，然后按下式计算：蛋白含量(mg/ml)=(144×OD280-075×OD260)×稀释倍数

   3) 毒性试验及细菌检查参考胸腺肽制备部分。

注意事项

IL2的制备过程类似细胞培养的过程，因此，其注意事项也类似细胞培养。IL2活性测定采用的是同位素掺入法，因此须按要求操作，防止同位素扩散和污染。