电感受态大肠杆菌TGl的制备

实验概要

本实验制备了电感受态大肠杆菌TGl细胞。

主要试剂

1. 基本培养琼脂板[10.5g K₂HPO₄、4.5gKH₂PO₄、1g(NH₄)₂SO₄、0.5g Na₃C₆H₅O₇2H₂O、15g琼脂加水至1L。高压灭菌，冷却至锥形瓶微温；接着加入lml lmol/L MgSO₄、0.5ml 1%维生素B：(硫胺)和10m120%右旋糖。

2. 2×Y培养基(将16g细菌培养用胰蛋白胨、10g酵母、5g NaCl加入到去离子水中并高压灭菌)。

3. lmol/L Hepes，(N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸])，pH7.4

4. lmol/L Hepes，pH7.4，10%甘油

5. 10%甘油

主要设备

1. 37℃孵育箱(NewBrunswickScientmc)

2. Sorvatl RC5离心机(或同类型)，GS3转头(均在4℃预冷)

3. 预冷的500m1聚丙烯离心管

4. 2L有挡板锥形瓶

实验材料

大肠杆菌TGl菌株(Stratagen)

实验步骤

1．将大肠杆菌TG1种到基本培养琼脂板，37℃过夜。

2．将基本培养琼脂板上的大肠杆菌TGl再接种到含有15m1 2XTY培养基的100ml形瓶中。37℃振荡培养过夜。

3．用5ml夜培养的TGl接种到两个含500m1 2×Y培养基的2L有挡板锥形瓶中。在摇床中培养约1.5小时，直到A₆₀₀接近0.5。

4．将菌液转移4个预冷离心瓶中(约250ml/瓶)。平衡后，置于冰上20分钟。

5．以3000g，4℃离心15分钟。使用前预冷所有转头。

6，弃去上清，并以起始体积的冰冷lmmol/L Hepes溶液(约250m1)重悬每个锥形瓶中的细胞。所有溶液都应当新鲜配置。

7．再次以3000g，4℃离心15分钟。

8．以一半起始体积的冰冷lmmol/L Hepes溶液(约125ml)重悬每个锥形瓶中的细胞；此时可合并到两个离心瓶中。

9．再次以3000g，4℃离心15分钟。

10．以总体积为20m1的10%甘油和lmm01/L Hepes混合液重悬所有细胞。

11．再次以3000g，4℃离心15分钟。

12．如果细胞不是新鲜使用而是储存，则需准备乙醇/干冰浴。

13．以总体积为2m1的10%甘油重悬细胞。

14．使用新鲜制备的细胞，或者用干冰浴等量分装冻存细胞。在检测效率后，及时使用细胞(在1周内)。

注意事项

1. 用于电转化的DNA不得含有盐分。细菌/DNA混合物中如有盐分可导致电弧(一种短路)的形成，应加以避免。

2. 在70℃10分钟的热灭活步骤后，可使用2/Il标准连接液进行连接。

3. 为构建抗体文库，所用DNA必须使用酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀法或选择合适的试剂盒(例如Geneclean或Qiagen)进行纯化。