实验概要
本实验用以血小板内皮细胞粘附分子（PECAM或CD31）为靶分子的活性筛选技术分离和培养纯的人毛细血管内皮细胞。
实验原理
PECAM是130kDa内膜糖蛋白，属于细胞粘附分子的免疫球蛋白超家族。该分子在细胞中呈组成型表达，基本上为内皮细胞和血小板所独有，只有一些骨髓谱系的亚种例外。PECAM在骨髓细胞或血小板上的表达不会干扰内皮细胞的分离，因为这些细胞在体外不稳定或不吸附。内皮细胞的任何特性，只要是组成型的和胞外的，都可用于顺磁波珠活性筛选。
主要设备
准备下列器械并消毒（高压灭菌，或者可能的话一次性使用）；
1. 大剪刀（2把）
2. 刮刀（2~3把）
3. 胰蛋白酶消化的烧瓶（每30g绞碎样品一个）
4. 带接液器的250uM钢筛网
5. 15ml和50ml离心管
实验步骤
1. 分离组织样品。所以操作在层流柜中进行。
1) 从腹整形样品分离
a. 解剖样品，去除任何皮肤、筋膜、肌肉等，只保留脂肪组织。称重样品，每10g分装一份。如果样品量很大，组织可在4℃储存24h，可成活毛细血管内皮细胞数有中等程度下降，但尚可接受。
b. 在无菌盘上，用剪刀将样品剪碎。
c. 用60ml注射器（不带针头）吹吸样品，反复3次或直至样品充分液化。
d. 取20ml组织放入装有20ml PBS的50ml离心管，混匀，700r/min离心5min洗出血水相，重复操作，直至样品相对无血。如果样品有脂肪组织，移走脂肪层之前的所有步骤必须在室温操作，以保持其流动性。
2) 从吸脂样品分离
a. 置真空包装样品于筛网上，用含0.5ug/ml两性霉素和200IU/ml庆大霉素，200ug/ml链霉素的PBS反复冲洗。冲洗过程中用刮刀在被冲洗无周围搅动，辅助冲洗。
b. 取20ml组织放入装有20ml PBS的50ml离心管，混匀，700r/min离心5min。吸掉含血水相。
2. PBS溶解BSA至终浓度4.0mg/ml（PBS/BSA）；过滤除菌。配制胶原酶溶液，PBS/BSA溶解胶原酶和DNA酶，终浓度分别为4.0mg/ml和0.02mg/ml，0.2uM滤膜过滤除菌。
10ml溶液大约可以处理10ml脂肪样品。
BSA
胶原酶A（胶原酶应反复试验，以寻找最佳分离浓度。经验表明，胰酶活性低的胶原酶似乎能更好地作用于脂肪组织）
DNaseI
3. 用无菌刮刀把步骤1中剪碎的脂肪组织刮到胰蛋白酶消化的烧瓶中，然后加入胶原酶，每ml组织加1ml。
4. 37℃ 80r/min旋动保温30min。注意观察样品溶解程度，若30min后只有少部分组织未溶解，继续下一步。想法则继续消化，每隔5min观察一次。再消化时间尽量不超过15~20min。
5. 消化的同时，用PBS稀释PBS/BSA（4.0mg/ml BSA）至BSA终浓度0.2mg/ml。消化过程是准备磁珠的最佳时间。
6. 消化样品倒入50ml离心管（每管约20ml）。
7. 吊筒式医用台式离心机室温1500r/min离心5min。
8. 液态脂和水相倒入另一50ml离心管。由于细胞沉淀极易被倒掉，最好使用无菌离心管。细胞沉淀略带红色，易见。若样品消化过度或胶原酶中胰酶活性偏高，样品水相由于含有断裂核酸会很黏。消化缓冲液中加入DNA酶可去除部分核酸，但溶液可能仍有一定粘度。液相粘度高，倾倒时也会带出细胞，弃掉上清时旋动有助于保留细胞沉淀。
9. 细胞重悬于5ml PBS（0.2mg/ml BSA），1500r/min离心5min，倒掉上清。沉淀悬于1ml含5%FCS的PBS（PBS/FCS）中。此时的样品已可用于筛选内皮细胞。若消化样品中留有任何筋膜，连接组织或其他成块的物质，用磁珠筛选前都需吸掉，此时的样品应是均一溶液。
10. 偶联抗 PECAM抗体的磁珠的制备
磁珠一旦偶联于抗体并经漂洗，可稳定贮存数周。但我们建议在分离步骤中用新制备磁珠，而在后面的传代过程中用贮存的磁珠筛选。
1) 短暂振荡，使磁珠溶液均一。
Amac磁珠
株数：每毫克2.5×108珠
结合能力：每毫克珠结合50ug IgG
浓度：10mg/ml
羊抗鼠IgG包被的顺磁玻珠
2) 用PBS稀释PBS/BSA（4.0mg/ml BSA）至BSA终浓度0.2mg/ml。
3) 取100ul磁珠（1mg）加2ml含0.2mg/ml BSA的PBS（20倍稀释磁珠混合物）。混匀，用钴-钐磁体分离样品。
4) 弃上清，沉淀悬于100ul PBS（含BSA 0.2mg/ml）。
5) 磁珠偶联抗PECAM抗体。
抗人CD-31（PECAM）单克隆抗体(M0823，克隆JC/70A，Dako）
特异性：抗人CD31
蛋白浓度：15.2mg/ml
鼠IgG浓度：260μg/ml
溶剂：IgG1, kappa
抗生物素蛋白/生物素作用
a. 每毫克磁珠加5μg IgG，PBS/BSA（0.2mg/ml）调节体积至200μl。
b. 室温保温15分钟。
6) 用磁体从上清中分离磁珠，弃上清。每毫克磁珠加3ml PBS/BSA（0.2mg/ml BSA），4℃可贮存数周。
11. 偶联了抗PECAM抗体的磁珠筛选细胞
用偶联于顺磁磁珠的抗体筛选内皮细胞特异抗原PECAM，从污染了非内皮细胞的样品中分离纯种内皮细胞。
1) 向步骤9的细胞样品中加入30μl偶联了抗PECAM抗体的磁珠。
2) 细胞和磁珠混合物冰上保温15min。
3) 磁体置于管侧5min，吸引筛选样品向磁体移动。小心吸弃上清，移开磁体。
4) 向磁珠中加2ml PBS/FCS，轻轻混匀，确保没有大的团块。用磁体重复筛选。
5) 重复步骤3和4三次。
6) 磁粒悬于1ml接种培养基中。
接种培养基
M199 培养基w/Earles盐（M199E)
20% FCS
补加
90μg肝素
70μg内皮细胞生长素
100IU/ml庆大霉素
100μg/ml链霉素
7) 重悬细胞接种明胶包被的T25板，每10g脂肪组织分离的细胞接种一块T25板，37℃振动培养。用1%明胶（溶于PBS）37℃预包被T25瓶2h以上。
8) 细胞长至足够密度时传代，在最初的两次传代中要应用筛选程序，确保内皮细胞纯度。
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