实验概要
本实验诱导表达了Arf-GST和OsAGAP-GST融合蛋白,纯化后测定了OsAGAP蛋白的Arf GTPase激活活性。
主要试剂
1. GST融合蛋白纯化试剂盒(Pharmacia公司)
2. Enzcheck TM Phosphate检测试剂盒(Molecular ProbesCo.)
实验步骤
1. Arf-GST和OsAGAP-GST融合蛋白的诱导表达
参照Pharmacia公司的GST融合蛋白纯化试剂盒说明书进行。
1) 将重组载体pGEX-4T-1-Arf,GEX-4T-1-OsAGAP以及作为对照的空载体pGEX-4T-1转入大肠杆菌BL21中;
2) 挑取单克隆接种于LB培养基中,37℃培养过夜;
3) 取过夜培养物按I/50的比例扩大培养至OD600为0.8-1.0,加入IPTG至终浓度为1mM,37℃继续培养4h;
4) 吸取lml培养物,离心收集菌体;
5) 向菌体沉淀中加入100ulSDS样品缓冲液,混匀,煮沸3-5min,离心取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测融合蛋白表达情况。
2. 酶溶法裂解细菌细胞
1) 将IPTG诱导后的培养物,4℃,5000rpm,离心5min,收集菌体;
2) 弃上清,按照每克细菌沉淀加入3ml裂解缓冲液的比例将沉淀悬浮(冰上进行);
3) 向悬浮液中加入蛋白酶抑制剂PMSF(50mM)及溶菌酶,搅拌20min,在搅拌过程中加入脱氧胆酸钠(冰上进行);
4) 溶液变得粘稠时,加入DnaseI,室温放置至溶液不再粘稠(冰上进行);
5) 4℃,12000g,离心15min,上清即为蛋白粗提液。
3. 用Glutathione Sepharose 4B进行融合蛋白的大量纯化
1) 将Glutathione Sepharose 4B柱体事先用1 X PBS平衡,之后加入细菌裂解液上清:
2) 室温下多次混匀,充分结合;
3) 待Glutathione Sepharose 4B颗粒自然沉降之后,缓慢放出液体:
4) 用10倍柱体积的1 X PBS清洗柱体,重复两次;
5) 按每lml柱体积对应于1 ml洗脱液的比例加入洗脱液,室温孵育10min使洗脱液中的还原性谷肤甘肤置换柱体中结合的融合蛋白;
6) 收集洗脱液;
7) SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的纯化及洗脱效果。
4. OsAGAP蛋白的Arf GTPase激活活性测定
GTPase测定实验使用Enzcheck TM Phosphate检测试剂盒(Molecular ProbesCo.)完成,操作参照试剂盒说明书。
将反应混合物(1uM Arf-GST融合蛋白,0.2 mM GTP,0.2 ml MESG,10ul purine nucleotide phosphorylase,HEPES buffer)加入1.5 ml Ep管中,22℃温育20min,以除去体系中游离磷的污染。反应混合物加入比色皿中,加入250 nMOsAGAP-GST融合蛋白,360nm立刻读数,然后每5min读数一次,至30min,根据读数绘制标准曲线。以不加OsAGAP-GST融合蛋白反应体系作为活性测定实验的本底对照。