实验概要
犬感染寄生虫病时即使没有明显的病理变化，但对整个消化道的负担是显而易见的。本实验中，我们从患有利什曼病的犬肠道中分离固有层细胞，以进一步探讨肠道内的寄生虫与内脏感染发病是否密切相关。
实验原理
取狗的活检样本，用胶原酶II培养。向细胞悬液中加入细胞表面和细胞内标记物。这些标记物由以前对利什曼病肠系膜固有层细胞的研究所确定。标记物的确定依据是，在这些感染利什曼病的的组织，特别是持续感染的组织中，肠道感染不会引起病变。
主要试剂
1. 磷酸盐缓冲液(PBS -氯化钠; KH2PO4的Na2HPO4和蒸馏水)
2. HBSS
3. 不完整/完整的(小牛血清)RPMI培养基
4. 肝素钠钠盐(HEPES，最低99.5％，Sigma -Aldrich公司)
5. Ⅱ型胶原酶
6. 皂素(Sigma公司，＃S-7900)
7. BSA(牛血清白蛋白)
8. Azida(2mM)
主要设备
1. 剪刀
2. 钳子
3. 培养皿
4. 1.5，2.0，15和50毫升管
5. 热孵化器（振荡器）
6. 细胞培养离心机（Thermo Scientific的multifuge X3R）
7. 巴斯德管
8. FACSVantage ®（Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA）
9. 结肠镜钳
实验步骤
1. 移取结肠活体穿刺组织用于分离固有层细胞。在培养皿中用不完全的RPMI彻底清洗全部结肠组织，将片段转移到另一个含有10mL完整RPMI的培养皿中，冰浴。
2. (细胞高效分离的关键步骤)用小镊子和手术剪清除结肠片段上的脂肪。
3. 将样品置于培养皿中缓慢(100RPM)搅拌10分钟。用巴斯德吸管取出上清液并丢弃，重复六次。
4. 将组织碎片转移到含有10mL培养液(DTT)的小培养瓶中，37℃振荡30分钟(120RPM)。可以弃去培养液，并重复处理30分钟。
5. 加入10mL洗涤液(HBSS/HEPES)，37℃振荡10分钟(120RPM)以清除DTT。
6. (关键步骤，必不可少)去除结肠组织中的胶原蛋白。
7. 向培养瓶中加入10mL胶原酶溶液，37℃振荡45分钟(120RPM)。
8. 将上层液体转移到15mL Falcon®管，4℃离心10分钟(1400RPM)，用0.5μL完整培养基重悬后置于冰中。所有这些步骤重复四次。
9. 将细胞放置于15mL Falcon®管中，加入9毫升蒸馏水裂解红细胞，10秒后添加1毫升PBS终止。4℃离心10分钟(1400RPM)，用0.5μL完整培养基重悬。
10. 用Neubauer 相机分析10μL样本中细胞的数量，将其调整至1×107个/ ml。细胞可被利什曼阴性犬血清封闭，并于冰上保存至少20分钟。
11. 利用活体染料台盼蓝(HBSS中浓度为0.4％)检验细胞活力，不被染色的细胞可以使用。
12. 用ADS稀释抗体作为表面标记，用透化缓冲液稀释抗体作为细胞内标记。
13. 将20 μL细胞悬液与抗体置于U型底的96孔板中(Limbro Biomedicals ® 175，Aurora，OH，USA )，细胞浓度为1×107个/ mL。
14. 将板冷藏15分钟，后加入150 μL 预冷的PBS，4ºC离心10分钟(1300RPM)，移除孔中的上层液体，向孔中加入200μL的2％甲醛以修复细胞。
15. 将孔中内容物加入到FACS(荧光激活细胞分选)管中，避光冷藏储存。
16. 取出上层液体用作细胞内标记(见表2)，加入150 μL PBS-W，4ºC离心10分钟(1300RPM)，再次取出上层液体。加入150 μL透化缓冲液，慢慢手动混合样品，室温反应10分钟，4℃离心10分钟(1300RPM)，除去上层液体。
17. 加入包括同种型的细胞内抗体，室温孵育40分钟。加入150 μL透性缓冲液，离心去除上层。此过程可以重复一次。
18. 细胞重悬于150 μL PBS-W液体中，离心去除上层。加入200 μL 的2％甲醛溶液并将孔内容物转移至FACS管，避光冷藏储存。
19. 在488nm波长下分析细胞(FACSVantage®流式细胞仪分析细胞，Becton-Dickinson，San Diego，CA，USA)。检测50 000个细胞，分析数据使用FlowJo软件版本7.2.5(Tree Star. Inc.，Ashland，OR，USA)。
20. 为了评估结肠固有层细胞的表型，可以有两种不同的方式，包括细胞表达给给定表型标记的百分比(％)和几何平均荧光强度(MFI)。细胞分析应侧重于亚群的组成，分别为：CD4，CD4，FOXP3，CD8，CD11b，CD11c，TLR9，TLR2，CD14和甘露糖。这提供了一个犬的粘膜在各种临床利什曼病中进行比较的机会。
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