实验概要
本实验以大蒜为试材介绍了mRNA制备的制备方法。
主要试剂
Trizol试剂,酚仿混合液(1: 1),异丙醇,70%乙醇,RNase-free水,OBB缓冲液,Oligotex凝胶悬浮液,OEB溶液,OW2 buffer,3 M NaAc
主要设备
高速离心机,1.5 ml离心管,电泳仪,电泳槽,涡旋器,水浴锅
实验材料
大蒜(Allium Sativum L.)
实验步骤
1. 植物总RNA的提取;
1) 取100 mg植物材料,于液氮中研磨至粉状,加入1 ml Trizol试剂,上下颠倒数次;
2) 12000转/min离心5分钟,取上清;
3) 酚仿混合液(1: 1)抽提两遍,离心取上清;
4) 加入1体积的异丙淳,沉淀5分钟;
5) 12000转/min于4℃离心5分钟,去上清;
6) 70%乙醇洗沉淀两遍;
7) 室温下干燥10分钟;
8) 沉淀溶于20 ul,电泳检测。
2. mRNA的纯化
1) 于1.5 ml离心管中加入250-500 ug总RNA,60℃加热3 min;
2) 加RNase-free水,漩涡混合5 sec;
3) 加500 ul OBB缓冲液,30 ul Oligotex凝胶悬浮液,混匀,70℃保温3 min;
4) 室温放置不超过30 min;
5) 15 000 X g离心3 min,去上清液;
6) 加400 ul OW2 buffer悬浮沉淀;
7) 转移至small spin column中,15 000 X g离心2 min,弃收集液;
8) 再加400 ul OW2 buffer于small spin column中,15 000 X g离心2 min;
9) 转移small spin column至一新的RNase-free的1.5 ml离心管中,加50 ul 70℃的OEB溶液,悬浮凝胶。15 000 X g离心2 min。
3. mRNA的浓缩
1) mRNA溶液中加入1/10体积的3 M NaAc,2倍体积的乙醇。-20℃下放置1 hr;
2) 8 000 X g离心15 min,弃上清;
3) 沉淀中加1 ml 70%乙醇,混匀后8 000 X g离心15 min,弃上清;
4) 将沉淀在空气中干燥10 min,用适量RNase-free水溶解。