超滤法检测体外多胺结合蛋白的分析

实验概要

本试验描述了使用大肠杆菌或酿酒酵母产生的鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白和放射性多胺来衡量多胺直接结合鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白的效率。

实验原理

多胺是所有活细胞内的脂质阳离子小分子化合物，以腐胺、精脒和精胺为主要代表。已揭示在某些重要的生物过程中，例如DNA、RNA和蛋白质的合成中，多胺可能具有一定的作用。但其作用机制目前还不够明确。本试验通过多胺体外结合蛋白的分析，来鉴别和描述新型多胺。本文采取超滤方法，分析多胺（精胺或胺）结合大肠杆菌或酿酒酵母产生的人或鸟的鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白。除了方便，快捷，此方法只需少量纯化的蛋白检测多胺的结合。

主要试剂

1．缓冲液（50mLTris-HCl，pH值7.8，4°C保存）

2．[3H]-精胺（(PerkinElmer，编号：NET522001MC）

3．[14C]-精胺（GE Healthcare，编号：CFA511）

4．6His-OAZ1（酿酒酵母）IMAC洗脱缓冲液（50mLTris-HCl，pH值7.8，含250mL咪唑）

5．大肠杆菌的模拟准备大肠杆菌细胞转化空载体表达的6His-OAZ1。

6． Scintillation液（(picard）

7．离心管（Eppendorf公司）

实验步骤

1．所有试剂置于冰上，离心机调至4°C。

2．标记离心管，预冷于冰上。

3．将多胺结合液分装于离心管，并标记A、B区分不同成分，预冷于冰上。

4．轻轻混合多胺结合液，孵育冰上60min。

5．将过滤装置放于1.5mL收集管中，冰上预冷。

6．经过60min的孵育时间，转移100μL多胺结合液于过滤装置。

7．纺纱2500xg过滤，5min，4°C。

8．准备含1 mL闪烁液的离心管（每次过滤准备2个含闪烁液的离心管），并保持在室温。

9．从内部切断过滤装置取出10μL滞留物，将其加入含闪烁液的离心管中，标记为“滞留物”。

10．从收集管中取出10μL滤液，加入含闪烁液的离心管中，标记为“滤液”。

11．离心10S，进行闪烁计数。

12．从CPM值（每分钟计数），利用如下公式计算多胺结合蛋白的百分比。

多胺结合百分比= {（滞留物的CPM-滤液的CPM）/滞留物的CPM }×100