实验概要
本研究以白皮松花粉为实验材料,用不同浓度钙通道抑制剂Nif处理花粉和花粉管,结合Fluo-3AM荧光标记探讨Ca2 在白皮松花粉萌发和花粉管生长过程中的作用。此外运用Ca2 螯合剂及外加钙调素研究Ca2 包括细胞壁钙库对白皮松花粉萌发和花粉管生长作用。
主要试剂
1. 蔗糖、CaCl2和硼酸均用双蒸水溶解,然后按所需浓度配制。
2. Nif购自Sigma,用无水DMSO溶解,配成10-3mol/L的贮存液。
3. Fluo-3AM: Molecular Probes产品,用无水DMSO溶解配成10-3mol/L溶液,于-20℃下保存。
4. 钙调素(CaM)购自Sigma,溶解配成7.5×10-5mol/L贮存液。
5. 多聚赖氨酸(Poly-L-Lys MW>300kD,Sigma)。
主要设备
激光共聚焦显微镜(ZEISS,Meta550)
光学显微镜(Olympus)
实验材料
白皮松花粉。采集白皮松散粉之前的成熟小孢子叶球(雄球果),置于室温下干燥48h,待散粉后,用无菌干燥小瓶收集成熟花粉,并密封保存于-20℃备用。
实验步骤
1. 配制含不同浓度Nif的培养基
1) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 (CKM)
2) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 1µM Nif
3) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 10µM Nif
4) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 100µM Nif
5) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 1mM Nif
6) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 2.5mM Nif
7) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 5mM Nif
称取花粉10mg,在室温下平衡30min,悬浮于10ml培养基中,25℃条件下摇床(120rpm)暗中培养。培养基中所含DMSO浓度低于1%,该浓度对于花粉萌发和花粉管生长无影响。
2. 外源细胞壁Ca2 及钙调素的作用
1) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 (CKM)
2) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 1 mM EGTA
3) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 1 mM EGTA漂洗白皮花粉10min,然后转移到CKM
4) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 1 mM EGTA漂洗白皮花粉10min,然后转移到CKM 0.1µM CaM
3. 花粉萌发率和花粉管生长速度的测定
萌发率的测定:花粉培养36h后萌发,每隔12h统计花粉的萌发率。当花粉管的长度大于花粉粒的直径时,花粉粒被认为萌发。在光学显微镜下统计出萌发和未萌发的花粉粒数,根据公式:萌发率=萌发的花粉数/总的花粉数×100%计算出萌发率。每个实验重复三次,每次所统计的花粉粒数目不少于300粒。
花粉管生长速率的测定:体外培养36h后,每隔12h取少量样品,用含有与培养基等浓度的蔗糖的3%多聚甲醛溶液固定30min。在光学显微镜下(Olympus)上选取已萌发的花粉进行测量。每个样品至少测定200个花粉管,计算出平均长度和标准差。用F检验和t检验分析处理与对照的差异显著性程度。
4. Fluo-3AM低温装载
不同培养基中培养的花粉,加入1mM Fluo-3至终浓度为10µM,混匀后放于4℃冰箱中轻微振荡2h后取出,用CKM离心洗涤3次,室温静置1h。将装载了Fluo-3AM的样品用多聚赖氨酸粘附在载玻片上,在激光共聚焦显微镜下用488nm对样品进行扫描,记录花粉管细胞质中Ca2 的分布情况。每个实验重复三次。