实验概要

    以西洋梨丰产为试材建立农杆菌转化体系，将抗真菌γ-硫堇蛋白Rs-afp₁基因转入梨离体叶片获得了抗病的转化植株。
 

主要试剂

1. YEB（5.0g/L牛肉胨，5.0g/LDifco Bacto提取物，1.0g/L酵母提取物，5.0g/L蔗糖，15g/L琼脂，50mg/L卡那霉素，pH值7.2。）培养基

2. Carb和Cef（医用，购自北京经科化学试剂公司，用无菌水配成500mg/ml母液，-20^oC保存。）

3. Kan（购自北京经科化学试剂公司，用无菌水配成10mg/ml的母液，过滤灭菌后-20^oC保存。）

实验材料

1. 西洋梨丰产

2. 抗真菌γ-硫堇蛋白Rs-afp₁基因

3. pGV双元载体

实验步骤

1. 载体构建

    抗真菌γ-硫堇蛋白Rs-afp₁基因是以从萝卜萌发的种子中提取的DNA为模板，经PCR扩增后的产物。其引物是：
                                Rs-1：5’-TATCTAGAATCATGGCTAAGTTTGC-3’
                                                                Rs-2：5’-TAGAGCTCATCT TATTATCCGTG-3’
        扩增产物的核苷酸序列包括编码Rs-afp₁的前原肽、单个内含子和终止子。构建嵌合基因所用的启动子为绿色组织特异表达的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的激活酶（activase）。以uidA（gus）为报告基因，将构建好的基因克隆到pGV双元载体内，然后转移到YEB培养基上，每两个月更换一次新鲜培养基。

2. 菌株培养与离体叶片感染

    农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105在液体YEB培养基中生长一昼夜（200r/min）。离心提取细菌后，在添加AS 20μM的液体再生培养基中洗涤悬浮，最后将农杆菌稀释至OD₅₅₀为 0.4左右。将切割好的外植体侵入菌液中，放置30min，取出后转移到与悬浮农杆菌相同的液体培养基中共培养。

3. 转化体的筛选与植株再生

    取出共培养后的外植体，用添加500mg/L Carb的无菌水冲洗干净表面的农杆菌，然后转移到不加Kan的再生培养基上进行预筛选，结束后转移到添加Kan 25mg/L的分化培养基上，诱导分化产生不定芽。整个筛选过程中，每隔两周更换一次新鲜培养基。

4. 检测

    选取抗Kan的新梢，在附加Kan25mg/L的增殖培养基上快繁；取转基因植株和对照植株的幼嫩叶片接种在含有Kan25mg/L的再生培养基中；在1/4 MS（KNO₃）   IBA 0.3 mg/L   Kan 20 mg/L  蔗糖2％的培养基上生根。其它培养基都附加蔗糖3％，pH5.6，培养条件同常规培养。再生植株的叶片用X-Gluc染色。染成蓝色的再生植株叶片和对照植株叶片采用CTAB法提取总DNA，进行PCR检测。提取质粒，用SstⅠ及XbaⅠ从质粒上切下一段带Rs-afp₁目的基因的片断作探针模板，用³²P放射性同位素标记，进行电泳、转膜和杂交、放射自显影。