一、原理
同大肠杆菌一样，根癌农杆菌细胞在对数生长的早中期，经一定浓度的CaCl2处理后也可进入感受态。通过低温处理和37℃热击可使中间载体质粒DNA容易进入到根癌农杆菌细胞中，并在其中复制与表达。已摄入外源质粒DNA的细胞可在含有适当抗生素的培养基上生长，而不含质粒细菌则不能在上面生长，借此可分离出携带中间载体质粒的根癌农杆菌。
二、目的
进一步了解中间载体质粒的特性，掌握中间载体质粒直接转入根癌农杆菌的原理和方法。
三、材料、试剂和器具
1、受体菌：农杆菌LBA4404（Rifr）。
2、中间载体质粒DNA（pBI 121, Kanr）。
3、20mmol/L CaCl2。
4、YEB液体和固体培养基（含相应抗生素）。
5、液态氮。
6、分光光度计。
7、冰块。
四、操作步骤
（一）感受态细胞制备
1、挑取一个单菌落接种于5mlYEB液体培养基中，28℃振荡（250rpm）培养过夜。
2、取2ml过夜培养物转入50ml YEB液体培养中，继续培养至OD600值约等于0.5。
3、将新鲜培养物转入50ml无菌离心管，冰浴中静置30分钟。
4、5000rpm离心5分钟，弃去上清液。
5、加入2ml预冷的20mmol/L CaCl2重悬菌体。
6、分装于无菌的Eppendorf管中，每管200ul，保存于4℃备用。
（二）转导
1、于一干净无菌的Eppendorf管中，加入20mg纯化的中间质粒DNA和200ml感受态细胞，混匀。
2、在冰上放置5分钟，转入液氮中冷冻8分钟，然后迅速转移到37℃水浴中温育5分钟。
3、加入800ul YEB液体培养基，28℃摇床上（250rpm）培养（预表达）4－5小时。
4、用微量加样器将转化的农杆菌移到含相应抗生素的YEB固体选择培养基平板上，用无菌玻棒涂布均匀。
5、室温下静置15分钟，然后倒置在28℃培养箱内，培养2－3天，直到长出单菌落。
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