植物组织中超氧物歧化酶活力的测定

实验概要

 超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（O2- ）的酶，它催化下列反应：                
反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

实验原理

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
  在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2- ，O2-  可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙。后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除O2- 从而抑制了甲腙   的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。  

主要试剂

1. 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）； 提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）； 2. 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml； 3. 750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存； 4. 100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； 5. 20μmol/L核黄素溶液：取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存。

主要设备

高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。

实验步骤

1．酶液提取  取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
  2．显色反应  取5ml指形管（要求透明度好）7支，3支为样品测定管，3支为对照管，另外1支作为空白，按表1-1加入各溶液。 混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。  表1  各溶液加入量

3．SOD活性测定与计算  至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性：          SOD总活性= ((A0-As)*VT)/(A0*0.5*FW*V1)          SOD比活力= SOD总活性/蛋白质浓度
  式中  SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示； A0—照光对照管的消光度值； AS—样品管的消光度值； VT—样液总体积（ml）； V1—测定时样品用量（ml）； FW—样重（g）； 蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g)。

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