贴壁因子使用方法：
①选择适宜的贴壁因子。
②将贴壁因子贮存液用三蒸水或PBS液或D-Hanks液稀释成0．1毫克/毫升的工作液。
③滤过除菌的工作液按50微升/平方厘米涂布培养器皿的细胞生长面。
④室温静置5分钟(胶原基质延长24小时)。
⑤除去多余溶液。
⑥涂布面用灭菌三蒸水洗涤后，再经细胞培养基浸泡过渡，备用。
微量元素
微量元素对细胞长期传代的作用于1981年由Murakam首先报道。硒元素不仅具有抗过氧化物酶对细胞的毒副作用，还可增强其它因子的作用，促进细胞生长。1983年，Clereand用一组复杂的微量元素，使8株杂交瘤细胞生长繁殖。这表明无血清培养液中补加的激素和生长因子的作用，可能是由于混杂一些重要的微量元素所致。
此外，实验证实长期使用无血清细胞培养基培养细胞，会改变细胞的某些特性。是因为在细胞传代时，常需借助酶的作用，无血清培养基缺乏对细胞保护的成分，残余的酶会对细胞造成损伤，因此无血清培养基内必须添加酶抑制剂以中止残余酶的作用。目前常用的是大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)，使用浓度为0．1％－0．5％，滤过除菌后，将其加在DMEM／F12基础培养液内。
目前无血清细胞培养基的应用仍处在探索阶段，尚无固定配方。应根据不同的细胞和不同的培养要求选择合适的补充因子。
◇无血清培养液培养哺乳动物细胞系(株)的特点
①无血清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，可能不适合另一种细胞株的生长。
②同源组织的不同细胞株，所需激素也不同。如人乳腺癌MCF-7和ZR-75-1两株细胞所需的转铁蛋白(TF)量前者大25倍，Ins的量后者大30倍。
③同一种细胞用的基础营养液不同，所需激素也不同。如HeLa在F12液需加Ins、TF、EGF、FGF和氢化考的松，而在HMCDB105液中只需加TF和EGF两种成分就能生长。
④不同来源的细胞株需要不同的激素和生长因子。如MCF－7细胞最需要EGF，HeLa细胞最需要氢化考的松和FGF。
◇胰蛋白酶液
胰蛋白酶(trypsin)是一种黄白色粉末，来自牛或猪的胰脏。当其水解蛋白质时，作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽腱，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰 蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1：250两种，即1份胰蛋白酶能解离125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织。胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和细胞的性质有密切关系。不同的细胞对胰蛋白酶液的浓度、作用温度和作用时间等要求也不一样。一般来说，浓度越大、温度越高、作用时间越长，对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度就会损伤细胞。常用的胰蛋白酶液的浓度是0．25％和0．125％，作用温度是37℃或室温，pH7．4左右。许多学者认为Ca2＋、Mg2＋和血清的存在，都会降低其活力，所以要用无Ca2＋、Mg2＋的D-Hanks液配制酶液。细胞一旦分散后，可用血清培养液终止其对细胞的消化作用。0．25％胰蛋白酶液的配制方法如下。
过滤消毒法
①按实验需要称取酶粉，用少量D-Hanks液将胰蛋白酶粉调成糊状。
②加适量D-Hanks液(橙红色)，磁力搅拌3～5天即可溶解(室温和4℃间断进行，室温高于30℃要减少酶液在室温中的搅拌时间)。
③溶解后的酶液(深红色)滤过除菌，分装，－20℃冻存。
高热消毒法
利用胰蛋白酶在酸性条件下有较好的热稳定性，对其进行高热消毒。
①按实验需要称取酶粉溶于1毫摩尔/升pH3．0的HCl中。
②酶液和2倍D-Hanks液同时在0．1兆帕，120℃条件下灭菌20分钟。
③两液冷却至室温时，等量混匀。酶液浓度高时，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，两液等体积混匀。然后用10摩尔/升的NaOH调消化液pH值至7．2(橙红色或深红色)。
④经计算，消毒后酶浓度下降50％。如消毒前酶浓度为0．1％－0．5％，消毒后为0．05％～0．25％。高热消毒法比过滤消毒法更加简便、安全、可靠。
◇EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶液
EDTA·2Na是一种化学螯合剂(商品名为Vorson)，它对细胞有一定的解离作用，并且毒性小，使用方便。常用D-Hanks液配—成0．02％EDTA工作液，高压灭菌后使用。EDTA的作用原理是：一些组织，尤其是上皮组织，在生长过程中需Ca2＋和Mg2＋维持组织的完整性，EDTA从细胞生存环境中夺取这些离子，形成螯合物，从而使细胞分离，因此，胰蛋白酶和EDTA混合使用可提高消化效率。EDTA只用于消化传代细胞。EDTA作用不受血清抑制，故消化后需彻底去除，否则会影响细胞生长。
◇胶原蛋白酶液
胶原酶(collagenase)的主要作用是使细胞间质的脯氨酸多肽水解，从而使细胞离散。胶原酶消化的不是细胞表面，而是细胞间质。该酶不同批号或同一批号不同生产日期都有质量差异。目前国内多数实验室使用的胶原酶大多是从芽孢杆菌中提取出来的。溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶中含羧菌肽酶(0．57—0．59单位/毫克)具有较强的细胞毒性，能破坏细胞膜上的蛋白质和多肽，从而导致细胞膜通透性改变。因此，用它消化组织时，应采取多步收集法(20～30分钟/次)，这样才可获得完整细胞膜和最大活细胞收率。胶原酶在Ca2＋和Mg2＋存在下仍有活性，血清亦不能抑制其活性，故消化后应充分漂洗。不同来源的胶原酶对于不同类型胶原纤维的水解作用强弱不等。
胶原酶液配制方法：用基础营养液或Hanks液配制，常用剂量分别为200单位/毫升或0．1—0．3毫克/毫升。胶原酶粉用Hanks或基础营养液调成糊状，液体加至定量后，置磁场搅拌至基本溶解，滤过除菌分装，－20℃冻存。
此外，链霉蛋白酶、胃胶原酶、透明质酸酶、粘蛋白酶、蜗牛酶和分散酶(dispase)都可作为消化液，但价格昂贵，保存困难，故较少使用，只在获取某类特殊细胞情况下使用。也有实验室将胶原酶和胰蛋白酶混合使用分离细胞，效果也不错。其原因是细胞间质的胶原结构对一般的蛋白水解酶有抗性，联用时，胶原酶首先水解胶原，继而胰蛋白酶协同解离细胞。
◇NaHCO3溶液
常用的浓度有7．4％、5．6％、3．7％三种，配制时用37℃三蒸水溶解后通过滤膜过滤除菌，分装于安瓿中，4℃冰箱保存，每支一次用完。使用时，NaHCO3液要逐滴加入，并不时搅动培养液，以防pH值过高。
◇10％醋酸液
高压灭菌，分装，4℃冰箱保存。使用方法和要求同NaHCO3液。
◇Hepes液
Hepes[4－(2－hydroxyethyl)，－1－peperazineethane sul－phonic acid]是一种氢离子缓冲剂，它可以长时间保持较强的缓冲作用，维持恒定的pH值。20毫摩尔/升的浓度对细胞无毒性，多数细胞都能适用。
L-谷氨酰胺2．9222克(M＝146．15)，加适量50℃三蒸水溶解，定容至100毫升，滤过除菌，1毫升/安瓿，－20℃保存。使用时每100毫升培养基中加1毫升谷氨酰胺。
在组织培养工作中，培养液内需加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。在特殊情况下，选择哪一种抗菌素、剂量多少、何时加入等等，与污染源、抗菌素的抗菌范围、抗菌素的稳定性等有密切关系。
◇青霉素、链霉素(双抗)液
用10毫升Hanks液或三蒸水溶解100万微克的硫酸链霉素，用8毫升硫酸链霉素液溶解80万单位青霉素粉，即成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。使用时，在100毫升培养基内加母液0．1毫升，则培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。
◇卡那霉素液
将1瓶卡那霉素(50000微克/瓶)溶于5毫升Hanks液中，即成10000微克/毫升的母液。使用时每100毫升培养基内加0．5毫升母液，即每毫升培养液内最终使用浓度为50微克/毫升。
◇制霉菌素液
因其不能溶于水，故只能制成5000单位/毫升的悬液，使用时每100毫升培养基内加0．5毫升悬液，即每毫升营养液内含25单位的制霉菌素。
◇细胞用液的分装方法
①使用正压滤器时，采用边过滤边分装的方法。瓶口的液体用于酒精棉球擦去，火焰消毒，加塞包装。
②使用负压滤器时，借助消毒吸管将液体移入分装瓶内，其它操作同上。
◇细胞用液的分装要求
①行严格无菌操作。尽量减少试剂在空气中的暴露时间。
②根据配量准备分装瓶和瓶塞，分装瓶规格、数量应根据实验需要准备。避免因包装瓶过大、贮液时间过长或反复冻融使用造成营养成分丢失和微生物污染。按一次用量或一周内用量挑选小包装瓶。融化后的液体置4℃保存。
③分装前做好分装量标记，分装瓶内液体量要小于瓶容积的2/3。
④做好分装瓶标记，包括试剂名称、浓度、配制日期、组号。
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