IgG4突变L234A和L235A，通过阻断Fc/Fcγ受体界面内的一个夹心脯氨酸基序，进一步降低效应功能。葛兰素史克2016年申请ZLWO2017079369，描述了新的IgG2 Fc和IgG4 Fc突变组合，特别是IgG4的E233P/F234A/L235A/G236del/G237A突变组合。
IgG4及铰链区
2. 延长半衰期的突变
半衰期对于任何用于治疗的IgG亚类都是至关重要的，可以帮助减少剂量或给药间隔。
Genentech是第一批申请ZL者，其基因突变可以增强人抗体与FcRn的结合。他们从WO200042072ZL家族获得了三项ZL，涉及307、380和434位点。434位突变的ZL只涵盖IgG1，在2020年到期。
另一个先驱，Medimmune(现属阿斯利康)，2001年从WO02060919申请家族获得了一项美国ZL(US 7083784)，并提出了广泛权益，涉及252/254/256/309/311/433/434/436位点的修改。该ZL涵盖了著名的M252Y/S254T/T256E(YTE)突变组合，该突变组合可使猴的血清抗体半衰期增加近4倍，并使motavizumab在人类体内的半衰期延长至100天。该家族还授予了其他七项ZL，将保护范围扩大到位于或接近Fc/FcRn接口的其他突变组合(308/311/385/386/389/428)。欧洲ZL则不同，因为EP1355919B1ZL主要保护单一252位点(Y、F、W、T突变)，EP2354149B1ZL主要保护433K/434F/436H组合，2022年到期。
从WO2004035752ZL家族中，Abbott被授予美国和欧洲两项ZL，其中包括T250Q/E和M428L/F替换抗体。不同亚类和不同CDR的抗体，包括突变组合T250Q/M428L(QL)，在恒河猕猴中表现出近2倍的IgG半衰期增强。
Xencor拥有多个广泛ZL，包括美国和欧洲的ZL：1)N434S、308 W、308 Y和308 F突变(WO2006053301家族，2026年到期)；2)M252Y/M428L和D259I/V308F组合(WO2009058492)；3)著名的M428L/N434S(LS)突变组合(WO2009086320)，据报在人类中有4倍的延长半衰期(将于2028年到期)。Xencor的ZL组合还包括T307Q/N434S、M428L/V308F和Q311V/N434S组合ZL。
2009年，LFB获得美国ZL(WO2010106180)，涉及12个突变组合，增强FcRn结合。
2009年，Genentech提出了一项ZL申请(WO2010045193)，以保护先前的申请中已经描述的位置的突变组合，特别是由T307Q/N434A突变组成的组合，它导致了25天半衰期。尽管被质申请疑新颖性，但美国和欧洲的申请尚未放弃。
其他申请，例如2013年的BioAtla(WO2013163630)。发布了几个不同突变，(US 20180186863)申请中的E258F/V427T突变组合。然而，在其他申请中并没有描述它们的突变体；示例部分只指出，与野生型Fc和中性pH下的正常结合相比，在酸性pH条件下，被测变异体的FcRn结合量为2~80倍。挪威奥斯陆大学(WO2017158426)、Kookmin大学(KR101792191多个申请)和MacroGenics(US20190010243)也发现了性能增强的新突变。
通过用带正电荷的氨基酸代替带负电荷的氨基酸，降低等电点，降低血清半衰期。例如，中外制药获得了一项广泛的欧洲ZL(EP 2006381)，该ZL涉及通过改变等电点的可变区域的任何修改来调节血清半衰期。Alexion和其他人一起反对这项ZL，中外制药的ZL最终被撤销，但中外制药对这一决定提出了上诉。
从WO2016227母体申请中，Xencor还拥有一项欧盟(EP3029066)和两项美国ZL(US 8697641和US9605061)，涉及恒定区域的等电点修改，但它们仅限于特定的突变组合。
IgG结合FcRn（Am J Transplant. 2019 July ; 19(7): 1881–1887）
3. 与稳定和下游工艺相关的突变
S228P突变解决了IgG4稳定性问题。
Celltech的研究人员在1992发表的文献表明，在IgG4以外的所有IgG亚类中都有一个S228P替换(脯氨酸存在于此位置)，足以消除人IgG4抗体的异质性。1994年，Celltech公司提出了一项针对E-选择素抗体的ZL申请(WO9526403)，其中包括降低效应功能的L235E替代和废除半抗体分子形成的S228P替代。然而，这种众所周知的突变从未得到过ZL保护。
这一发现对IgG4衍生抗体的发展产生了重大影响。这种突变几乎包含在大多新开发的IgG4抗体中。
2006年，IgG4稳定ZL转移到CH3，通过突变R409来解决IgG4在低pH条件下聚集的问题(WO2006033386)。在示例部分，他们表明S228P/L235E/R409K变异体在低pH条件下比S228P/L235E变异体表现出较少的聚集倾向。美国和欧洲的ZL都被授予了关于抑制IgG4聚集的突变组合的广泛权益。
Genmab申请(WO2008145142)，描述了一个相同的突变减少了Fab-Arm的交换，但是他们欧洲ZL遭到反对，主要是因为之前协和麒麟的ZL。
Genmab对其他改善稳定性突变的申请(WO2010063785)，例如K370Q/E(以及其他)，都获得了美国和欧洲的ZL。2016年，他们还提交了一份申请(US2017029521)，要求在370位置进行任何突变，但仅限于由CXPC或CPXC(非S228P)序列组成的多肽铰链区域。
2010年，Biogen提出ZL申请(WO2010085682)，该技术涉及IgG 1 CH3结构域的琼脂化、稳定IgG4。他们的想法是构建一种具有大量突变的沉默的IgG，以减少由酰基化引起的热稳定性损失。他们描述了许多突变，例如297、299、307、309、399、409和427位点突变，以及与疏水斑块中大量疏水氨基酸相关的valine替换(在240、262、264和266中)。然而，他们撤回了申请。
S228P并不是唯一既能调节二硫键形成又能稳定分子的突变。2010年，UCB提出了一项申请(WO2012022982)，并获得了广泛IgG4的欧洲ZL，在131位的任何氨基酸替换为上铰链中的半胱氨酸。除了S228P突变外，他们还产生了大量的IgG4变异体，Fab热稳定性增强，产品异质性降低。然而，与唯一的S228P突变相比，尚不清楚这些新的突变是否具有真正的优势。
中外制药获得WO2009041613家族的欧洲ZL，包括删除G446和K447，减少IgG4C末端异质性。根据他们的序列列表和他们的主张，这种保护适用于任何具有S228P突变的IgG4。尽管中外制药通过删除G446和K447氨基酸而具有降低C端异质性的ZL，但仅K447的缺失已被用于一些抗体中，如blosozumab (anti-sclerostin),dupilumab (Dupixent®, anti-IL-4Rα), emibetuzumab (anti-cMet), ixekizumab (Taltz®, anti-IL-17)。光是这种突变似乎不被任何ZL所涵盖。根据中外制药ZLWO2009041613的说法，与唯一的K447缺失相比，它的双重缺失可以进一步降低异质性。
根据Bristol-Myers Squibb在2017年提交的WO2018119380申请，S228P稳定的IgG4会导致不良的生物分析和生物加工。在示例部分，他们发现S228PIgG4在CEX-HPLC上可能是以双峰形式逃逸，可能是由柱内的两种结合构象引起的。为了限制这种行为，在重链中引入了突变。主要在196位任何其他氨基酸取代赖氨酸，或在217/220/(224或225)位置替换赖氨酸。
参考文献：
Jose M. M. Caaveiro et al，Structural analysis of Fc/FccR complexes: a blueprint for antibody design，Immunological Reviews 2015 Vol. 268: 201–221
Christophe Dumet，Insights into the IgG heavy chain engineering patent landscape as applied to IgG4 antibody development，MABS，2019。
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