酵母遗传学方法3：RNA的分离

酵母RNA的分离

1）总酵母RNA的分离

1．在每毫升培养物中加入50μg环乙酰亚胺，在30℃下振荡15分钟。此步亦可省略，但是有人认为环乙酰亚胺可防止mRNA凝集在多核糖体上。

2．迅速冷冻收集细胞，在大离心管中加入约一半体积的碎冰，将培养物倒入，振荡，在4℃下以5000r/min离心5分钟。

3．加入11g玻珠于30ml离心管中，以Corex玻璃离心管为最佳，不过塑料离心管也能使用。

4．加入3ml已用LETS缓冲液平衡的苯酚到玻珠中。

LETS缓冲液：

0.1 mol/L 氯化锂

0.01  mol/L Na₂EDTA

0.01  mol/L Tris-HCl (pH7.4)

0.2% SDS

0.1% 二乙基焦碳酸（可任选）

5．用2.5ml冰预冷的LETS缓冲液悬浮细胞，并将其加入到上述玻珠苯酚管中。为了使细胞破碎的最好，液面应刚好高于玻珠表面。

6．高速振荡30秒后，在冰上置30秒，交替进行3分钟，用相差显微镜检测细胞破碎情况，破碎的细胞呈现无折射的空细胞。

7．当至少90%细胞破碎后，用5ml冰预冷的LETS缓冲液，轻微振荡，用Sorvall SS－34转头以8000r/min离心5分钟，使溶液分相。离心后，酚层和蛋白质界面应刚好低于玻珠表面，移出水相而不会触动界面。

8．将水相转到一个干净离心管，用5ml苯酚：氯仿：已戊醇（25：24：1）抽提2次，避免触动界面。用氯仿抽提一次。

9．加入1/10体积的5mol/L氯化锂，在－20℃下沉淀3小时。此时，RNA沉淀可在－20℃下存放。

2）Poly(A)⁺RNA的分离

1．将保存的RNA用Sorvall SS-34转头以10 000r/min离心10分钟，收集RNA沉淀，用80％乙醇洗涤。真空干燥后，溶于2.5ml蒸馏水中，溶解后加入2.5ml 2×上样缓冲液，同时加SDS至终浓度为0.3％。

2．置65℃保温5分钟。

3．装一个oligo（dT）柱，用1×上样缓冲液洗3次。

4．用10mmol/L HEPES（pH7）洗脱Poly（A）^＋RNA。如果希望得到更满意的结果，可用加入RNase抑制剂。

5．用蒸馏水对Poly（A）^＋RNA进行10倍稀释，通过OD₂₆₀的光吸收测定RNA浓度。用水将10mmol/L HEPES(pH7)稀释10倍作为对照。

6．加1/10体积3mol/L醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇沉淀RNA，上下倒置混匀，在－70℃下放置30分钟。离心10分钟，弃上清液，用水溶解RNA沉淀使终浓度为1mg/ml。不管是溶解的RNA或是乙醇沉淀的RNA都能在－70℃下长期保存。