2 )超声破碎法
( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液:
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 % 溴酚蓝
20 % 甘油
实验方案
1、外源基因的诱导表达
( 1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。
( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,
确定无误后进行下一步。
( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。
( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 )细菌的裂解
常用方法有:① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:
① 4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL )。弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀。