α-淀粉酶测定方法的比较

  α-淀粉酶(EC3．2．1．1)测定方法很多，尚难以标准化。碘淀粉比色法、因底物和产物不确定，线性差而不能满足准确性要求。最近IFCC批准了用亚乙基封闭的G7-pNP作底物的酶偶联法(EPS法)作为临时推荐方法，但该法需工具酶，延迟时间长，还不是最理想的参考方法。使用2-氯-4-硝基苯-麦牙三糖(G3-CNP)作底物直接测定淀粉酶也有多篇文献报道，该法延滞时间较短，CNP的摩尔消光系数不易受pH的影响，C3-CNP法更符合IFCC提出的理想Amy测定方法的条件，但因受内源性葡萄糖昔酶的干扰，而且使用NaN3或KSCN可能导致α-淀粉酶的异构，同时带来其它一些不利因素，被IFCC拒绝成为参考方法。最近，日本Toyob。公司新底物2-氯-4-硝基苯-o-半乳糖-麦芽糖苷(Cal-G2-α-CNP)，与G3-CNP相比，在非还原性末端用半乳糖代替葡萄糖，从而避免了内源性葡萄糖苷酶的影响。我们对此作了方法学探讨。现将报道如下：

       淀粉酶能水解3个葡萄糖单体以上的以α-1，4糖苷键相连的麦芽寡糖，Winn Deen等经实验证实Amy对G3-CUP比G3-pNP的催化速度快10倍，从而使G3-CNP可用为α-淀粉酶的底物。根据IFCC所提出的理想的测定方法条件：要求不使用辅助酶，反应产物具有确定的结构，产物组成恒定等，G3-CNP或Gal-G2-CNP更符合这一要求。Gal-G2-α-CNP的结构式如下：↑所示为淀粉酶作用部位，而α葡萄糖苷酶在此部位无水解作用。

       α-葡萄糖苷酶能水解G≤3的麦芽寡精，但非还原性末端用半乳糖代替后则不能水解，即内源性葡萄苷酶对Gal-G2-α-CNP无水解作用。本文实验在试剂中加入α葡萄糖苷酶对结果无影响，证明可以避免内源性葡萄苷酶的干扰。由于血清中淀粉酶存在起源于胰腺P和唾液腺S的两种同工酶，它们对同一底物Km不同。曾对一唾液样品测定Km，测得Km＝1．44，明显高于急性胰腺炎血清标本。说明在该系统下测定S型淀粉酶时，底物浓度不足，Emily认为加入154mmol／L的NaN3对两种同工酶具有相同的激活作用，但NaN3可能对α淀粉酶有异构作用，故本文建议不加入NaN3。考虑价格因素也不增加底物浓度，这样更能反映淀粉酶对急生胰腺炎的诊断价值。

       本法与EPS法相比，两者相关良好，测定结果都使用国际单位，但本法结果明显高于EPS法，也许Gal-G2-α-CNP是淀粉酶更适宜的底物。文献在其它方法之间对比也如此，因此为了便于测定结果的可比性，在报告单上注明方法是必要的。

       由于淀粉酶测定主要用于急诊检验，因本法延迟时间短，线性时间长，线性范围宽，可改为固定时间法，适合于手工操作，也适合于尿液测定。

       总之，本法不需要辅助酶，不受内源性葡萄糖苷酶的干扰，延滞时间短，线性范围宽，试剂稳定性好，不失为测定淀粉酶的理想方法。