组织印迹的Northern杂交

1）硝酸纤维素膜或尼龙膜上的组织印迹

1．在塑料板上放置两层Whatman 1号滤纸，在滤纸上方放上一张普通纸，然后铺上一层尼龙膜。

2．用双面刀片从植物组织如大豆的茎上切取一块切片（厚度约为1mm）。如果组织表面是湿的，则在Kimwipes纸上轻轻吸干或先用蒸馏水洗涤几秒钟然后再用Kimwipes纸吸干。用镊子将组织切片转移到硝酸纤维素膜上，注意一旦将切片放置在膜上就不得再移动切片。在切片上放置4层Kimwipes纸，用手指轻压15～20秒，用镊子小心拿开纸和组织切片。组织切片经甲苯酸蓝染色后观察其解剖结果。

3．80℃真空烘烤留有组织印迹的尼龙膜2小时或用UV cross-linker在紫外光下照射尼龙膜。

4．将留有印迹的膜面向下，放入载玻片上的一滴甲苯酸蓝溶液中，对组织切片进行染色。2～3分钟后，吸干多余的染料，用间接照明立刻照相。将载玻片翻转，透过玻璃拍摄被染色的组织切片。在切片上粘上几张纸片以免组织切片接触显微镜。

2）用³⁵S－标记的RNA探针检测植物印迹中的mRNA

1．在Seal-A-Meal^TM塑料带中倒入30～40ml洗涤溶液I，65℃清洗留有印迹的尼龙膜4小时。

2．将膜放入20ml杂交溶液中，68℃预杂交4小时。

3．将膜和用³⁵S-标记的RNA放入10ml杂交溶液中，68℃杂交20小时。

4．在100ml洗涤溶液Ⅱ中42℃清洗尼龙膜20分钟，换上新鲜洗涤溶液，重复清洗2次。

5．用100ml洗涤溶液Ⅲ在适当的温度下（60～68℃）。用手提式微型检测器监控尼龙膜上剩余的放射性。清洗完毕后，有义RNA探针杂交的膜不再有放射性信号，但用反义RNA探针杂交的尼龙膜一般具有可检测的放射性信号。该信号的强度依赖于目的RNA的丰度。室温下用0.2×SSC对尼龙膜进行简单清洗，在空气中晾干。

洗涤缓冲液Ⅲ：

0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)

1 mmol/L EDTA

6．将膜暴露在X-射线胶卷或Kodak T-max 400胶卷下进行放射自显影。用水平力如一小叠书使膜和胶卷保持良好的接触。一般来说，利用T-max 400胶卷比X-射线胶卷具有更高的分辨率。放射自显影的时间依赖于放射性信号的强弱，通常从4小时到4天。

7．在X-射线处理器中对X-射线胶卷显影。把T-max400胶卷浸入Kodak T-max显影液I中显影1分钟，将底片转移到显影终止盘中30秒后浸入Kodak快速定影液中5分钟，然后用蒸馏水洗涤5分钟。

8．在解剖显微镜下观察组织印迹中mRNA的位置。用Kodak Technical Pan Film 2415胶卷拍摄mRNA的定位模式，然后和用苯甲酸蓝染色的组织切片解剖结果比较。