DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)和BMD(Becker Muscular Dystrophy)是一种常见的X连锁隐性遗传病,主要发生于男性,其发病率为1/3500活产男婴,其发生的原因是Dystrophin(抗肌萎缩蛋)其固缺陷所致.
一、DMD/BMD的临床表现
在临床上DMD较BMD常见,发病早,症状重,正常于2-3岁即出现骨骼肌无力的表现,一般从骨盒带肌肉无力开始而出现一系列的特殊症状:走路困难呈鸭步,出现Gower's征,腓肠肌进行性肥大.逐渐出现心肌细胞受损,约30%的小儿智能力缺陷.在12岁左右失去能力,至20岁时正常死于呼吸衰竭和心力衰竭.而BMD相对来说症状较轻,进展亦较慢.
二、DMD/BMD的遗传病
(一)遗传方式:X-连锁隐性遗传,发病者多为男性,其母亲为致癌基因携带者,尚有1/3的患者为散发病例,则新生突变引起.
(二),DMD/BMD的致病基因:1.基因定位:DMD/BMD是因位于Xq21,其基因非常大约为2400Kb.2.基因结构:该基因共有79个外显子,78个内含子,其CDNA全长约为13974个时,编码的肽链含3685aa残基,编码蛋白命名为dystrophine,其基本5个独立的启动子,在DMD基因内还存在一些STR,已知有13个STR,其中5'端编码区有8个,3'端编码区有1个,44,45,49,30,50内含子各有一个STR,是多为DNDR核心是(CA)n.等位基因数目为2-19个.
三、DMD基因的突变类型
(一)缺失与重复:研究表明约65%的DMD/BMD是由于基因内的部分缺失所致,尚有12.5%病例有基因内重复,这种突变变有两个高频发生区,一个在基因的5端,另一个大致在第45~55外显子区域,而5'端的缺失重复热点大致在第1~7外显子区域.缺失的范围从1至数个外显子,甚至整个DMD基因亦可发生缺失,启动子区亦有缺失发生.
(二)单碱量换:近年来的研究还发现,在DMD基因内尚有单碱其置换,目前已发现的约有6种,根认为在DMD患者中由此型突变引起者占30%左右.
(三)基因内连接形成和mRNA剪接异常:以上两种类型的突变亦在DMD人群中有抗,但因研究的病印例尚少,需要进上步的研究.
四、利用PCR技术诊断DMD的途径
(一)用PCR技术检测缺失型突变.
利用PCR可直接检出DMD/BMD的缺失型突变,由于DMD/BMD发生时,其65%的患者为基因缺失所致,因此直接检测缺失可使65%的患者得到诊断.在DMD/BMD基因的缺失中,其缺失范围,缺失的位置具有高度异质性,加之DMD/BMD基因较大,很难用一对引物确定其缺失部位,随着DMD/BMD基因的克隆及其精结构的阐明,有人开发了多时引物进行多重PCR,从而可使几乎全部的缺失型DMD/BMD得到诊断.
1.利用6对引物扩增处于缺失热点区域的6个外显子,即外显子8,16,19,44,45和48,再加上外显子4,12,51的3对引物,可检测80%的缺失,若再用Beggs等设计的另外九对引物即外显子3,6,13,46,47,49,50,52,30,60及启动子的引物,进行多重PCR,可使98%的缺失型患者得到诊断,各引物的序列及扩增片段大小见表.
在用多重PCR进行DMD/BMD基因的缺失型检测时方便简便,快速,在扩增后,用琼脂糖凝胶电泳溴乙锭染色可根据扩增产物的有无判断结果.扩增时的分清情况见下表:
DMD基因PCR扩增引物
外显子 | 引物序列(5'--3') | 产物片段 |
Pm | GAAGATCTAGACAGTGGATAC ATAACAAATGCATG | 535 |
TTCTCCGAAGGTAATTGCCTC CCAGATCTGAGTCC | ||
3 | TCATCCATCATCTTCGGCAG ATTAA | 410 |
CAGGCGGTAGAGTATGCCA AATGAAAATCA | ||
4 | TTGTCGGTCTCCTGCTGGTC AGTG | 196 |
GAAAGCCCTCACTCAAAC ATGAAGC | ||
6 | CCACATGTAGGTCAAAAA TGTAATGAA | 202 |
GTCTCAGTAATCTTCTTAC CTATGACTATGG | ||
8 | GTCCTTTACACACTTTAC CTGTTGAG | 360 |
GGCCTCATTCTCATGTTC TAATTAG | ||
12 | GATAGTGGGCTTTACTTA CATCCTTC | 331 |
GAAAGCACGCAACATAA GATACACCT | ||
13 | AATAGGAGTACCTGAGAT GTAGCAGAAAT | 238 |
CTGACCTTAAGTTGTTCT TCCAAAGCAG | ||
17 | GACTTTCGATGTTGAGAT TACTTTCCC | 416 |
AAGCTTGAGATGCTCTCA CCTTTTCC | ||
19 | TTCTACCACATCCCATT TTCTTCCA | 459 |
GATGGCAAAAGTGTTG AGAAAAAGTC | ||
43 | GAACATGTCAAAGTCA CTGGACTTCATGG | 357 |
ATATATGTGTTACCTAC CCTTGTCGGTCC | ||
44 | CTTGATCCATATGCTTT TACCTGCA | 268 |
TCCATCACCCTTCAGA ACCTGATCT | ||
45 | AAACATGGAACATCCT TGTGGGGAC | 547 |
上 | CATTCCTATTAGATCTG TCGCCCTAC | |
47 | CGTTHTTHCSTTTHTCT HTTTCAGTTAC | 181 |
GTCTAACCTTTATCCA CTGGAGATTTG | ||
48 | TTGAATACATTGGTTA AATCCCAACATG | 506 |
CCTGAATAAAGTCTT CCTTACCACAC | ||
49 | GTGCCCTTATGTACCA GGCAGAAATTG | 439 |
GCAATGACTCGTTAAT AGCCTTAAGATC | ||
50 | CACCAAATGGATTAA GATGTTCATGAAT | 271 |
TCTCTCTCACCCAGT CATCACTTCATAG | ||
51 | GAAATTGGCTCTTTA GCTTGTGTTTC | 388 |
GGAGAGTAAAGTGA TTGGTGGAAAATC | ||
52 | AATGCAGGATTTGGA ACAGAGGCGTCC | 113 |
TTCGATCCGTAATGA TTGTTCTAGCCTC | ||
60 | AGGAGAAATTGCGCC TCTGAAAGAGAACG | 139 |
CTGCAGAAGCTTCCA TCTGGTGTTCAGG |
(二)单个碱基置换的检测
单碱是置换在DMD/BMD的发生中占有重要地位,但DMD/BMD是因单碱基置换近年来才受到人们的重视,它对发现新突变,确定单碱基置换与DMD/BMD发生的关系具有重要意义,推测的方法主要是用RT-PCR-SSCP及全套式RF-PCR检测.
(三)利用PCR-RFLP和Amp-FLP进行连锁分析诊断DMD/BMD
若在一个家庭中,已有一个先证者,则首先利用多重PCR检测其缺失,若不能确定其缺失的部位或不能诊断,或其它条件所限,则可用PCR-RFLP和Amp-FLP进行连锁分析,确定风险染色体.
1.PCR-RFLP
用多重PCR不能检出非缺失型DMD/BMD患者及携带者,现在可用PCR方法扩增多态性位点区域,同适当的内切酶酶解扩增产物,电泳分离后可对多态性位点进行分布,利用PCR-RFLP连锁分析,即可进行DMD/BMD风险个体的携带者的检出,下表序列即为常用的几个多态性位点检测时的引物及扩增酶解情况.
扩增区域 | 引物序列 | 限制性酶 | 扩增产物 | 水解片段 |
PERT87-1 | 5'GTCAGTTGGTCAGT AAAAGCC3' | B5+NⅠ | 400bp | 400/250+150 |
PERT87-8 | 5'CCAATTAAAACCA CAGCAG3' | TaqⅠ | 155bp | 145+10/74+ 71+10 |
pERT87-15 | 5'GACTGGAGCAAGG GTCGCC3' | XmaⅠ | 740bp | 730+10/520+ 210+10 |
PERT87-15 | 5'ACAATTTCCCTTT CATTCCAG3' | BamHⅠ | 226bp | 216+10/166+ 50+10 |
MPIP | 5'TCCAGTAACGGA AAGTGC3' | AluⅠ | 60bp | 60/56or52 |
841Q | 5'ATAATTCTGAATA GTCACAAAAG3' | MaeⅢ | 252bp | 236+16/128+ 108+16 |
2.AmP-FLP
在DMD/BMD基因区内有多个(CA)n重复区域,这些区域可用OCR方法进行扩增,增产物同聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分析扩增片段大小,然后与先证者及母亲进行对比,亦是检出患者与携带者的理想多态性标记,现将在我国人群中已作分析的(CA)n区引物及多态性片段,PIC列表示下:
位置 | 名称 | 等位基因 | 引物序列 | 片段 | PIC |
5'脑组织特异启动子 | DYS-Ⅱ | 8 | F5'TCTTGATATATAGGGA TTATTTGTGTTTGTTATAC | 214-218 | 0.750 |
R5'ATTATGAAACTATAAG GAATAACTCATTTAGC | |||||
3'非翻译区 | 3'CA | 4 | F5'GAAAGATTGTAAACTA AAGTGTGC | 119-137 | 0.375 |
R5'GGATGCAAAACAATG CGCTGCCTC | |||||
内含子 | 44CA | 9 | F5'TCCAACATTGGAAAT CACATTTCAA | 174-204 | 0.072 |
R5'TCATCACAAATAGAT GTTTCACAG | |||||
45CA | 7 | F5'GAGGCTATAATTCTTT AACTTTGGC | 156-184 | 0.772 | |
R5'CTCTTTCCCTCTTTAT TCATGTTAC | |||||
49CA | 11 | F5'CGTTTACCAGCTCAA ATCTCAAC | 227-257 | 0.870 | |
R5'CATATGATACGATTC GTGTTTTGC | |||||
50CA | 4 | F5'AAGGTTCCTCCAGTA ACAGATTTGG | 233-251 | 0.718 | |
R5'TATGCTACATAGTAT GTCCTCAGAC |
不应用内含子进行连锁分析时,可用44/49,45/50两组双重PCR同时扩增,亦可在这些组中,将缺失热点的引物加入,形成多复PCR,连锁分机与缺失检测同时进行.
五、DMD/BMD的PCR快速前诊断
过去DMD/BMD的PCR快速产前基因诊断主要采用RFLP连锁分析,由于该方法探作复杂费时,提供的信息量有限,因此不能满足临床诊断的要求,目前主要应用PCR法进行产前诊断.
产前快速基因诊断常用以下两种途径
1.四步法:
(1)性别确定.━━(SRY引物+DMD课题内对照)
(2)先证者缺失型基因检测(多重PCR)
(3)胎儿缺失型的确定(多重PCR+单对引物PCR)
(4)Amp-FLP+PCR-RFLP确定非缺失型式携带者
2.一步列位法:董尚志等人在上述方法的基础上建立了一步到位快速法,该系统包括以下三组多重PCR体系.
①5'pmCA+e12+MP1P
②e17+44CA+49CA
③e17+45CA+50CA
应用上述三组多重PCR不仅可将女性的两条×染色体分开.而且能检出染色体的.另有一组,SRr+e44定胎儿性别及44外显子的缺失.一步到位法快速,方便,它不仅能检测缺失,亦可对非缺失型的DMD/BMD进行连锁分析.