RFLP法
1)常规制备DNA
盐析法
1.用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出白细胞。
2.每3ml细胞悬液加10ml红细胞裂解液溶解红细胞两次,再加2ml白细胞裂解液溶解白细胞。
3.加50μl 10% SDS和70μl蛋白酶K消化蛋白质,37℃过夜或55℃ 3h。
4.加0.25体积饱和醋酸钠溶液,剧烈摇动15s。
5.2000r/min离心15min,收集上清。
6.加入2.5倍预冷无水乙醇沉淀DNA,-20℃过夜。
7.吸取DNA团块用70%乙醇洗3次,每次10 000r/min,10min。再溶于适量TE缓冲液中,4℃保存。
酚抽提法
1.采集EDTA抗凝血0.5ml,加双蒸水2.5ml,溶解红细胞。
2.离心10 000r/min,5min,弃上清。
3.加0.5ml生理盐水,混匀,离心10 000r/min,5min,弃上清。
4.加500μl TES,混匀,再加20% SDS 25μl,蛋白酶K 4μl置55℃水浴4h或37℃水浴过夜。
5.加等体积饱和酚,混匀,离心10 000r/min,5min,吸取上层水相,再加等体积饱和酚抽提一次。
6.加等体积氯仿:异戊醇再抽提一次。
7.吸取上层液,加1/10体积醋酸钠,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃过夜,沉淀DNA。
8.吸出DNA团块,用预冷70%乙醇洗1次,弃尽液体,真空抽干DNA,加适量TE溶解。4℃保存。
2)限制性内切酶消化
在无菌EP管中依次加入双蒸去离子水7μl,10×缓冲液2μl,限制性内切酶1μl,DNA 10μl。反应体系含1×缓冲液、DNA 5μg、酶10U。稍离心以混匀,37℃水浴1~1.5h。酶解结束后向反应管中加1/10体积的终止液终止反应,冷却至4℃,准备电泳。
3)琼脂糖凝胶电泳
1.配制1%琼脂糖凝胶板:取0.4g琼脂糖加40ml TBE,微波炉熔化,加少量双蒸水补充蒸发的水分,将其冷却至60℃,倒入凝胶槽内,充分凝固后拔出样品梳。
2.从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽,加入1×TBE,使其液面略高于琼脂糖板。
3.DNA样品按4:1的比例加样液,全部加样于琼脂糖板的样品孔中。
4.电泳80V,约2h。
5.取出凝胶板,置溴化乙锭溶液中染色30min。
6.紫外灯下观察结果,可用全色黑白胶卷拍照,镜头加红色滤色镜,光圈2,速度15~40s。
4)分子杂交
DNA转移
1.将琼脂糖凝胶切下,放入盛有变性液的搪瓷盘中,浸泡15~20min,用蒸馏水洗涤2~3次,用中和液再浸泡15~20min。
2.取一托盘放入10×SSC缓冲液,托盘上放一转移用支架,支架上搭滤纸桥,使溶液能够虹吸上来。
3.在支架上依次放入Whatman 3MM滤纸,处理好的凝胶,硝酸纤维素膜,Whatman 3MM滤纸,吸水纸,玻璃板,适量重物500~1000g。
4.放4℃冰箱转移12~16h,中间更换吸水纸。转移结束后,去除上面的东西,用镊子将膜取出,用清水冲洗一下后,让膜自然晾干。
5.80℃真空干燥2h,将DNA固定于膜上,保存于干燥处待用。
预杂交液
将转移好的硝酸纤维素膜用2×SSC溶液浸透,装入可加热封口的杂交袋中,按0.2ml/cm2加入适量预杂交液,用塑料热封口机封口。于37~42℃预杂交4~6h。
杂交
1.将塑料袋剪一小口,取出预杂交液。
2.将标记好的探针加热变性,煮沸7min,骤冷至0℃,加入杂交液。
3.将含探针的杂交液加入袋中,封口。
4.42℃水浴杂交20h,取出杂交液。
洗膜
1.1×SSC,0.1% SDS室温15min×2。
2.0.25×SSC,0.1% SDS室温15min×2。
放射自显影
1.洗涤后的膜置于干净的滤纸上,室温自然晾干。
2.用塑料薄膜包好膜,做好标记。
3.在暗室内将2张X线胶片放在增感屏的内侧,并将硝酸纤维素膜放在2张X线胶片之间。
4.盖严暗盒,放-50℃冰箱放射自显影2~7天。
5.在显影液中显影2~4min。
6.在定影液中定影20min。
7.用清水洗胶片20min,晾干,读片检测结果。