CDNA文库筛选
（一）λgt11 cDNA文库铺平板
宿主细菌制备
1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。
2．将过夜培养物以3000×g离心5min。
3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高压灭菌）重悬细胞沉淀。
4．细胞悬液可用于4℃贮存至一周。
预制噬菌体悬液铺平板
以已知滴度（如，已知每ml噬菌体颗粒数）的cDNA文库或其他噬菌体悬液开始，用λ－dil稀释以达到所需每平板噬菌体数。每个90mm直径平皿5×103个噬菌体/100μl开始筛选。
铺平板
1．将所需数量的LB平板置42℃温箱预热。
2．LB顶层琼脂（每平板最少2.5ml）用微波炉熔化，然后置49℃水浴中。
3．为温箱内的每一个平板准备一个12ml带螺旋盖试管，于室温，放在合适的架子上。
4．用移液器每管加100μlλ－dil稀释的宿主细胞悬液。
5．每管加100μl稀释的噬菌体悬液与细菌于漩涡器上简短混合。
6．含细菌和噬菌体（感染混合物）的试管于37℃温育25min，然后室温放置。
7．用一支消毒的10ml玻璃移液管在本生灯火焰上稍稍预热，取2.5ml保存在49℃的熔化顶层琼脂加到一支含感染混合物的试管内。
8．立即在手掌之间滚动混合管内混合物，然后均匀地倒入一个预热的LB平板上。
9．倒好的平板于室温置水平面上直至顶层琼脂凝固（至少5min）。
10． 重复步骤7至9，直至所有的细菌和噬菌体混合物都铺平板。
11． 平板置42℃温箱（对λgt11）直至噬菌斑长出。
（二）杂交筛选——cDNA序列作为探针
1．如上述将文库铺平板，噬菌斑杂交实验用E.coli宿主菌株Y1088。
2．噬菌斑于42℃生长过夜。
3．从温箱取出平板，置4℃冷却至少1h。
4．膜剥离：首先，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上给准备影印的平板编号。其次，从平板的中央开始向边缘小心将滤膜铺在菌台上。当滤膜完全变湿后（颜色变灰），再等30s。同时，用针头在平板上标出滤膜的3个不对称位置。小心将滤膜从平板上剥离，接触面向上放在一张干净的Whatman 3MM滤纸上。在进行下一步骤之前，所有的平板重复步骤4。
5．将滤膜接触面向上漂浮在变性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/L NaCl）中5min。
6．中和5min。
7．用2×SSC洗涤5min。
8．将滤膜放在一张新的Whatman 3MM滤纸上，用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。
9．在真空炉中80℃烘烤2h。
10． 用6×SSC预先短暂地湿润滤膜，然后用预洗液（50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS）于68℃预洗涤至少1h。用一个盘子放在水浴摇床上。
11． 将25张滤膜转移到一个装有50ml杂交液（5×SSPE；1×Denhardt’s液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的贮存罐内（直径至少90mm），68℃预杂交2h。
12． 对于每ml杂交液，2倍的105至1×106cpm的双链探针经沸水浴变性10min后，迅速放冰上冷却。
13． 变性探针立即加到预杂交混合液中。
14． 在封口的贮存罐内于68℃杂交过夜，不断地晃动以防滤膜粘在一起。
15． 杂交结束后，滤膜用2×SSC，0.01％SDS于室温洗涤3次约1h。
16． 将潮湿（防止干燥）的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或X光片上，用放射性墨水在针头标签上作标记。
17． 滤膜用塑料包装袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光过夜。
（三）免疫筛选
制备Sepharose偶联细菌裂解液
1．各用一个E.coli温度敏感溶源菌株（BTA 282（λgt11amp3）或BNN 97）单菌落接种于2×7.5ml培养基并于32℃生长过夜。
2．过夜培养物用LB培养基稀释100倍，于32℃生长至OD600值为0.5。
3．于45℃温育15min诱导噬菌体表达。
4．培养物于39℃进一步培养约2h。
5．测定噬菌体含量以便收集，氯仿测定操作步骤：3滴氯仿加到1ml培养物测试样品中，混合物于37℃温育。另一份不加氯仿的培养物作为平行对照。温育5min后，测试样品与对照比较。如果添加氯仿的测试细胞悬液清澈透明，细菌完全被吸附，刚好开始裂解，此时已可收集培养物。
6．于4℃以4000×g离心10min收获细菌。
7．从开始的两份7.5ml培养物离心得到的细胞沉淀用冷的偶联缓冲液重悬并再次离心。
8．各用5ml冷的偶联缓冲液重悬细胞沉淀。
9．超声波处理细胞悬液，直到粘度增加至不再释放出核酸。
10． 将细菌裂解物偶联到预先制备好的溴化氰活化Sepharose 4B于4℃过夜。
11． 以3000×g离心5min回收偶联物。
12． 用偶联缓冲液重悬沉淀并再次离心。
13． 为了饱和溴化氰活化Sepharose的未结合反应基团，沉淀物用冷（4℃）的饱和缓冲液重悬并在旋转轮上于4℃温育1h。
14． 通过三次连续的洗涤除去未吸附蛋白质，开始用洗涤缓冲液（pH4.0）；然后转换至pH8.0；最后一次洗涤pH为4.0，在这个处理前后和每次洗涤之间，在4℃，2500×g离心5min，收集材料。
15． Sepharose偶联细菌裂解液可以PBS悬液（＋0.01％硫柳贡）于4℃贮存几个星期。
用于筛选的抗体预吸附
1．浓度为0.5至1 mg/ml未稀释的第一抗体和第二抗体（如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体，Calbiochem公司）分别用1.7倍体积的Sepharose偶联细菌裂解液混合，并在旋转轮子上于4℃温育过夜。每次筛选循环约需要300μl已处理的第一抗体（最终工作稀释度为1：100）和15μl已处理的第二抗体（最终工作稀释度为1：2000）。
2．悬液加到少量玻璃棉填充的加样器吸头内。未封闭抗体用冷冻封闭液（至少5倍于柱体积）洗脱。
3．用冷的封闭液调节洗脱出的抗体浓度至原先浓度的1/20。加入硫柳汞（终浓度0.01％）。
铺平板
1．如上所述铺制平板，作如下修改：
a. 另外一支含2.5ml顶层琼脂的12ml带螺旋盖试管置49℃水浴中以铺制诱导对照平板。
b. 在一份感染混合物中，用100μl噬菌体悬液含已知百分比的具有完整β-半乳糖苷酶基因的野生型噬菌体作为诱导对照。
c. 在加相应感染混合物前，为铺制诱导对照平板20μl X-gal立即加到2.5ml顶层琼脂中。
2．于42℃温育3～4h（用E.coli Y1090）直至噬菌斑可见。
3．将平板移到层流橱内，用IPTG浸泡过的硝酸纤维素滤膜覆盖在上面以诱导噬菌体lacZ基因表达。对每个平皿，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上编号，然后在平皿内用IPTG溶液浸泡。排去平皿边缘多余的液体，然后从平板的中央开始往边缘小心地将滤膜放在长有细菌的平板上。滤膜总是用平头镊子操作。
4．于37℃温箱倒置培养过夜。
5．诱导对照平板上的某些噬菌斑过夜培养后，由于完整的β-半乳糖苷酶表达将变成蓝色，表明IPTG诱导成功。
6．从平板上剥离滤膜前，应该用针头在滤膜上标出3个不对称位置。
7．然后小心地从平板上剥离滤膜，接触面向上放在Whatman 3MM滤纸上，直至所有的滤膜揭下。
免疫学染色
1．为了洗去顶层琼脂上的残余物和细胞碎片，将硝酸纤维素滤膜一次最多5张转移放在摇床上的盘子（10×250px）内，用25ml TBS室温洗涤10 min 2次。
2．然后滤膜用25ml封闭缓冲液（每张90mm直径的滤膜至少15ml）于室温温育30min，以封闭滤膜上的非特异性结合位点。不断晃动以防滤膜互相粘在一起。
3．每张滤膜置佩特里平皿中，各用3ml含预吸附第一抗体的封闭缓冲液温育。多克隆第一抗体的经典工作稀释度为1：100。抗体的这种工作稀释度可以重复使用到5次并于4℃保存。室温下用第一抗体温育至少2h。为了确保滤膜仍然完全浸泡在抗体溶液中，温育过程中，将平皿放在摇动平台上。
4．室温下用25ml TBT洗膜3次，每次10min，并不断摇动以除去未结合第一抗体。
5．本步骤操作同步骤3。3ml封闭缓冲液内预吸附第二抗体的工作稀释度通常为1：2000（如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体，Calbiochem公司）。第二抗体工作溶液使用不得超过一次。第二次使用后，第二抗体工作溶液的吸附能力似乎耗尽，经常导致阳性信号的突然丢失。
6．用25ml TBS于室温下摇动洗膜3次，每次10min以除去未结合的第二抗体。
7．在一个塑料盘内，45ml冷（4℃）的酶反应缓冲液与5ml冷（－20℃）的氯萘酚和50μl H2O2混合。将滤膜一次最多5张放在显影液内并缓慢搅动。几分钟内阳性噬菌斑显示出紫红色。
8．如果用Polaroid摄影术（665型胶卷，光圈4.5，快门速度1/15，橙色滤光片）记录结果，将硝酸纤维素膜放在曝光箱内。
9．为了有助于挑取阳性菌体斑，在拍照的透明胶片上用针头做相应的标记。
噬菌斑纯化
1．用一支消毒的钝头巴斯德吸管刺入对应于阳性菌体斑位置的顶层琼脂，通常很容易从平板上取下薄的环状顶层琼脂并用0.5ml λ-dil重悬于一支Eppendorf管内。
2．挑取的噬菌斑所含的噬菌体颗粒通过剧烈的旋涡振荡至少1h，从顶层琼脂释出，在再次铺平板前，新制备的噬菌体悬液置室温下至少1h。
3．在10－3至10－5范围内稀释的噬菌体悬液重悬筛选阳性信号。
4．重复步骤1至3，直到从一个原始噬菌体感染在顶层琼脂上挑取一个阳性噬菌斑为止。
噬菌体增殖
1．为了获取高滴度的均一噬菌体悬液，每个噬菌斑噬菌体悬液取150μl至250μl，加入E.coli Y1088铺平板以便扩增。
2．于42℃过夜培养后，每噬菌体克隆的一个平板裂解物用7ml λ-dil覆盖，于室温持续摇动5h提取噬菌体颗粒。
3．用一支消毒的10ml移液管吸取含噬菌体的上清液，小心避免细胞碎片。加入几滴氯仿，上清液可作为噬菌体贮存液于4℃无限期保存。
4．每毫升悬液噬菌体原种滴度应在109～1010噬菌体颗粒范围内。如果噬菌体原种未包含足够的噬菌体，重复步骤1～3，直至达到足够的噬菌体滴度为止。
5．必须通过对高度稀释的噬菌体原种（最多几百个噬菌体）再次铺平板测试噬菌体原种的均一性，并用探针重新筛选。至少99％的测试的噬菌体是阳性才能认定测试的噬菌体原种是“均一的”。
（四）噬菌体颗粒纯化，DNA分离和亚克隆
1．准备10个LB平板，用E.coli Y1088铺平板，每个平板至少105个噬菌体。42℃温育过夜。
2．含噬菌体上清液按前述方法制备，从所有平板收集上清液（10×5ml）。
3．将收集的上清分成两份25ml分装于40ml聚丙烯离心管内。
4．加入25μl RNA酶A和DNA酶I完全消化细菌核酸，于室温放置30min。
5．每管加入1.46g NaCl并使之完全溶解，室温放置1h后，于4℃以10 000r/min离心10 min除去细胞碎片。
6．将上清转入一干净40ml聚丙烯离心管，加入2.5g PEG，于室温持续搅拌30min使其完全溶解，置冰上过夜PEG促使噬菌体颗粒形成沉淀。
7．于4℃以10 000r/min离心10min回收沉淀的噬菌体颗粒。
8．弃上清液，小心用软纸擦拭离心管内壁。
9．将来源于同一噬菌体克隆的两份沉淀物用4ml SM重悬并收集。用5ml移液管上下抽吸使乳状沉淀物混匀。
10． 加4ml氯仿，旋涡振荡30秒，去除PEG；于4℃以1 600×g离心15min。
11． 将水相（顶层）转移至一干净的12ml聚丙烯管内，用SM精确地调节体积至4ml。弃去胶状的有机相和中间相。
12． 在一支14ml polyallomer超离心管（Kontron公司）内，氯化铯分级梯度的制备从底层至顶层：3ml氯化铯密度为ρ＝1.7；1.5ml（ρ＝1.5）；1.5ml（ρ＝1.45）。
13． 每4ml SM噬菌体悬液溶解2g固体氯化铯。
14． 将噬菌体悬液置氯化铯分级梯度上，在Backman SW40转头或相当的转头上以30 000r/min于4℃离心2h。
15． 小心从转头内取出离心管，放在强光下。此时噬菌体颗粒清晰可见呈乳状条带位于1.5和1.45密度区的中间相。用18G针头从离心管旁侧刺入，以收集噬菌体颗粒。约1.5ml体积。
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