（四）染色原理及步骤
1．基本原理 酶标抗体与荧光色素标记抗体的染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在每一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80%～90%的抗血清系由家兔制得，而绝大数单克隆抗体系由小鼠制备）；第二抗体则为第一抗体（家兔/小鼠的IgG）的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种属，同一标记的第二抗体就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以间接法为常用，在此着重介绍间接法的染色程序。
2．染色程序
（1）切片准备：见第一章 。
①石蜡切片经二甲苯或Hemo-De脱蜡，下行酒精至水。②固定/无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥2h以上。
（2）未固定的新鲜组织切片，丙酮固定20～30min(fretrieval )，简而言之，即用蛋白酶处理，去除固定剂交联造成的空间遮蔽（室温），风干15～30min.;已固定的组织冰冻切片及石蜡切片，根据需要可进行组织抗原的激活。
（3）用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以避免孵育液流失及孵育过程中切片干燥，同时也能节 省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，风干。石蜡切片（滴少量PBS，以防其干燥）直接进行步骤（6）。
（4）切片经PBS或其它缓冲液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰冻切片上的OCT包埋剂。但应用ALP标记抗体时，禁用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，因后者可使ALP失活。
（5）根据需要，用甲醇+0.3%H2O2处理切片15～30min（室温），封闭内源性过氧化酶的活性。应用ALP标记抗体时，此步可省略。
（6）PBS漂 洗2min（共两次），移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%Triton X-100)中5min（室温）。Tween-20为一种表面活性剂，除具有清洁作用外，还可增加组织的通透性，有利于组织细胞内抗原的显示。
（7）4%Block Ace或0.1%～1%BSA湿盒内孵育15～25min（室温），然后；轻轻弃去孵育液（不冲洗）；以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色。
（8）根据需要，可用1/5～1/30正常来活兔/羊血清孵育15～20min（室温，以酶标抗体相同种属正常血清为宜，最好是同一动物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀释酶标抗体时，加入1%～2%的同一种属正常血清。
（9）轻轻弃去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀释的第一抗体（抗体用量：每张切片一般为50～80μl），湿盒内孵育1～2h（20～25℃）；免疫电镜用标本，4℃过夜。
（10）PBS充分冲洗（3次×2min），以去除切片上非特异吸附的抗体。应用不同的第一抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。
（11）经0.05%Tween-20/PBs 2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀释的HRP酶标记的第二抗体,湿盒内孵育45～60min(20～25℃)。
（12）PBS漂洗（3次×2min）,此处不需分别漂洗，因所有切片均系同一酶标抗体孵育。
（13）未固定或固定较弱的冰冻切片，此处可轻微固定。首先将切片从PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸钙而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min（室温）此时轻微固定，既不影响抗原抗体结合，又较有利于保存第一抗体孵育前的组织抗原，尤其适用于单克隆抗体的ICC染色。
（14）呈色：HRP标记抗体的呈色液为0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片经PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液内10～15min（室温、暗处），亦可镜下控制显色速度。终产物为棕褐色沉淀。用于电镜观察的标本，呈色3～5min即可，防止DAB终产物向周围扩散，影响超微结构定位。另外，显色液应于用前新鲜配制，避免DAB本身氧化变质。新配制的DAB为无色透明液体。若DAB液已氧化变为紫红色，应换新药重新配制。
（15）将切片置流水中（仅光镜观察）或PBS（电镜标本）内，终止呈色反应。
（16）未固定的冰冻切片，可用1%戊二醛-PBS液加强固定5～10min（室温），流水冲洗。
（17）细胞核轻度染色，以甲基绿和苏木精为常用。前者细胞核呈绿色，与HRP/ALP等终产物对比度尤佳，但不适于微波照射的标本。苏木精是组织学、病理学研究中普遍应用的核染色方法，与HRP、ALP的终产物对比度比较好。
（18）DAB呈色的标本，可以系列酒精脱水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物质呈色的标本，在有机溶剂中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固剂如明胶甘油等封固，次日，于盖玻片周围涂少许女士用指甲油，可使切片保存时间更长。
（19）镜检、观察记录同一般形态学研究。
（20）免疫电镜用标本，经OSO4后固定，按电镜标本要求处理（参见本书第七章 ）。亦可OSO4固定，喷碳（Carbon Coating）,利用扫描电镜观察抗原的存在部位。
3．酶标抗体及发色剂的选择
HRP特异底物为H2O2,在分解H2O2过程中,与H2O2形成复合物,无电子供体存在时,反应不再进行,当电子供体存在时,迅速生成水,酶被还原,电子供体被氧化环化,形成苯乙胼聚合体(图4-2)。在酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。
图4-2 DAB反应产物形成过程
HRP催化的酶促反应第一步是特异性的—酶催化底物H2O2，其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体，可使终产物呈不同颜色，例如：CN（4—Chloro—1– N aphthol）为蓝黑色，TMB（Tetramethyl—Benzidine ）为深蓝色，AEC（3—amino—9– ethyl--carbazole）为红色。市售试剂盒所配显色液以AEC居多，室温下较稳定，但不能进行脱水等处理，且时间长易褪色。DAB是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明、半永久保存，且终产物具有嗜饿性，经O2O4处理，电子密度增加，适于电镜下确定抗原的存在部位。但是DAB被认为可能具有致癌性，所以应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。
（2）ALP，是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。显色液内加入终浓度为2～4mmol/l 的levamisole, 大多数内源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole）以每毫升60～120mmol/L浓度的贮存液-20℃冰箱保存。应用时稀释30倍。为避免反复称取，试剂吸水，As-Mx、FR、FB试剂均应小量分装后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制内源性碱性磷酸酶活性。例如：以每次所用显色液30ml计算，分装As-Mx 5～7mg/支、Fr 8mg./支、FB7mg/支，每次使用一支，用前稀释30倍，过滤显色 。FR、FB等在光照射条件下易引起沉淀，故显色反应在暗处进行。
（3）GOD，是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate）0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但GOD的敏感度较HRP和ALP为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法和敏感性和特异性。即用GOD和HRP分别标记第二、第三抗体（例第一抗体为小鼠单克隆抗体、第二抗体为GOD标记的兔抗鼠IgG，第三抗体则为HRP标记的羊抗兔IgG），ICC染色，以葡萄糖-DAB作显色剂。基本原理如（图4-3）。在这里HRP是作为第二酶系统，利用葡萄糖氧化时生成的H2O2作底物，催化酶促反应，不受内源性过氧化酶的影响。而且GOD和HRP所标记的抗体是结合在同一抗原位置，所以能良好地显示组织抗原的存在。其主要染色步骤为：
①切片经第一抗的孵育；②漂洗，GOD标记的第二抗体孵育40～60min（室温）；③漂洗，HRP标记的第三抗体孵育30～45min（室温）；④漂洗，显色、脱水透明观察同前。
图4-3 两步酶催化反应原理
二、非标记抗体酶法
由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法）。现分述如下。
（一）酶桥法
1．基本原理 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。
2．染色步骤 主要程序如图4-4
图4-4 酶桥法主要染色步骤
（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A）孵育24h（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。
（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a IgG抗体）孵育1～1.5h（室温）。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。
（3）切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育1～1.5h（室温）。因抗酶抗体和第一抗体均系种属a IgG，具有相同的抗原性 ，所以 桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。
（4）切片与酶（HRp 70～100μg/ml,PBS溶解）孵育0.5h（室温），酶与抗酶抗体结合。
（5）显色等与酶标抗体法相同。
酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。
（二）PAP法
1．PAP的制备及特征 PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。
（1）制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0kg以上），可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共10mg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂[（福氏完全佐剂，含HRP3.3mg(RZ=3.0)];间隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg；再间隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP0.1mg/ml）为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。
（2）制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ≥3），而制备PAP复合物时，HRP的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。
【步骤】
①取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml）的水溶液。
②混匀，室温1h后，离心16000g 4℃15min。
③0.9% NaCl(冷盐水)溶解沉淀，离心16000g 4℃15min，重复4次。
④加15.3ml HRP水溶液（含HRP30.64mg），室温，持续搅拌。
⑤用1N HCl及0.1N HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1N 及0.1n NaOH调pH至7.2。
⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置0℃45min。
⑦离心35000g 0℃15min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。
⑧用10.50ml水溶解沉淀，对透析液（48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水5.94L）透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。
【质量鉴定】
制备的PAP复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定PAP复合物的质量。常用分光光度计检测PAP的复合物在280nm（IgG的最大吸收波长）和400nm（HRP的最大吸收波长）的光密度值（OD值），按下式计算IgG和HRP的含量：
一般HRP/抗HRP的克分子比达1.9时，可分装冷藏于-85℃冰箱，据报告如此冷藏的PAP复合物可保留14年之久，活性无改变。但稀释后的PAP复合物不稳定，4℃可保存2～3周。最好临用前配制。
【PAP复合物的特征】
PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H2O2-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm 。这种结构异常稳定。据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。
2．PAP染色原理及步骤
（1）原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。
（2）染色步骤：主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。
①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法；切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。
②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。
图4-5 PAP法主要染色步骤
③用离体制得的PAP复合物（1：30～300稀释）孵育1～1.5h（室温），使其被桥抗体连结在第一抗体上。亦可用ALP抗ALP复合物代替。
④显色观察等同间接法。
3．PAP法的评价 PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。其主要特征和注意事项如下：
（1）抗体活性高：非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结）对抗体活性的损害。
（2）灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感2倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：1标记，而PAP复合物含有3个HRP分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以PAP法应较敏感。我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N）表示。据此，Sternberger(1979)认为PAP法较间接法敏感20～25倍，可进一步稀释第一抗体，以节 省其用量。但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。笔者在实验中注意到，PAP显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，PAP法亦为阴性。其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离）的Fab段少，PAP复合物被连结的相应减少有关。另外 ，PAP复合物分子量较大（400KD）,冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体（分子量90～180kDa），所以不适于免疫电镜的标本制作。
（3）背景染色低：在酶标抗体法中，被标记的非特异性抗体可与组织成分结合，造成背景染色（图4-6）。从理论上讲，在非标记抗体法，连结抗体中，即使存着非特异性抗体，因其不是抗第一抗体种属IgG的特异性抗体，故亦不能与抗HRP抗体结合，不能把PAP复合物连结在此非特异性抗体上（图4-7）。当然，PAP复合物内也可能存在些非抗HRP的抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分结合，但因其不是抗HRP的抗体，故不能与HRP结合，无酶活性。因此说桥抗体的引入，使ICC的特异性得到了双重放大，S/N增大。但也有人认为，过量的桥抗体及PAP复合物等均易与Fc受体结合，致使背景染色增强。实验表明：合适的切片准备、恰当地应用封闭性阻断剂、正常血清以阻断非特异性结合，加之适当地选择抗体稀释度和抑制内源性酶活性，PAP法和间接法二者的背景均相当低。
图4-6 间接酶标抗体法
背景染色增高原因
图4-7 PAP法降低背景的原理
（4）假阴性及其处理：应用PAP法显示抗原含理较多的组织或冰冻切片组织抗原保持良好的标本时，可导致阴性结果，这种现象称为假阴性。Vandesand发现：应用PAP法显示大鼠视上核和室旁核内加压素神经细胞分布时，第一抗体（1：200）染色，加压素含有细胞呈强性。如果取材前24～48h，脑室内注射秋水仙素，阻断轴突运输以增加视上核和视旁核加压素含量，同时组织标本经脱水、透明、再水化等处理以增加抗体的通透性，同样稀释度染色，结果却阴性。进一步实验发现：增加抗体的稀释度，开始出现阳性染色，稀释至1：1500时，染色最强，继续增加抗体稀释度，染色强度则下降。Bigbee（1977）认为假阴性是第一抗体用量过高与组织抗原结合过多，使相邻两个伉体的Fc段间的距离（d）恰好是连结抗体的两个Fab段与之结合的长度，于是连结抗体不存在游离Fab段，仅剩无活性的Fc段，所以不能将PAP复合物连结在与组织抗原结合的第一抗体上，结果阴性（图4-8）。因此，借助PAP法研究组织抗原分布，特别是新鲜组织冰冻切片组织抗原保存较好时，第一抗体尽量用高稀释度，避免假阴性。石蜡切片很少发生这种现象，所以PAP法在石蜡切片的ICC观察中更为常用。
图4-8 示假阴性：组织切片上结合过多的第一抗体，两抗体间的距离d 恰好适于桥抗体的两个Fab段与之结合，无PAP复合物结合的位置
（5）桥抗体：也称连结抗体，它的两个Fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力。因此，当第一抗体和PAP复合物中抗HRP抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述两种抗体结合，起到桥的作用。为了确保桥抗体的两个Fab段之一与第一抗体结合、另一个与抗HRP抗体结合，桥抗体需用高浓度。另外，在非标记抗体酶法中可用葡萄球菌蛋白A（SPA）代替桥抗体，进行ICC染色。SPA不受种属限制，应用范围广。
（6）PAP复合物：在PAP法及酶桥法中，特别强调第一抗体和抗HRP抗体必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连结在一起；但一些研究表明：第一抗体和抗HRP抗体来自不同种属，连结抗体仍可作为桥，将二者连在一起。例如Erlandsen发现豚鼠IgG作为第一抗体，可用羊抗兔IgG、兔PAP复合物显示之一。Grzanna（1982）根据这一报告，利用豚鼠抗DBH血清作第一抗体，羊抗兔IgG为桥抗体，12例兔血清制得的PAP复合物中，仅3例染色较佳。这种第一抗体和PAP复合物来自不同种属获得的阳性结果主要依赖于种属间的交叉反应。多数实验表明：抗体和种属交叉反应是有限的，也是不完全的。故利用桥抗体进行ICC染色时，仍以第一抗体和抗酶抗体来自同一种属为宜。
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第三节 结果分析
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