酶免疫技术酶与底物

酶结合物是酶与抗原或者抗体、半抗原在交联剂作用下联结的产物,是 ELISA 成败的关键试剂。它不仅具有抗原抗体的特异性反应,还具有酶促反应的特性,最终产生生物放大的特性。酶免疫反应中,最常用的酶是辣根过氧化物酶,HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H₂O₂)和供氢体(DH₂)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:

供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。如 DAB(3,3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜做免疫酶染色或电镜观察。5-氨基水杨酸(5-AS)早期曾用于 ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。邻联甲苯胺(OT)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度的影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。HRP 最常用的色原底物(供氢体)有邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)以及4-氨基安替比林等,其中 OPD 形成的产物为深橘黄色或棕色,但是因为具有致癌性,且显色不稳定,因此近年来人们更愿意用性质更稳定又无致癌作用的TMB。TMB 产物为蓝绿色,可溶性较好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度比 OPD 可高4倍以上。另外,还有一种供氢体称2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)(ABTS),其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS 与 TMB 皆是值得被优选的供氢体。

由于 HRP 的底物 H₂O₂ 本身又是酶的抑制剂,因此酶促反应中使用的 H₂O₂ 不能过量,应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰(说明 H₂O₂ 已消耗殆尽)。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。