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TRIZOL提取注意事项-3

2019.8.02
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zhaochenxu

致力于为分析测试行业奉献终身

3.台式离心机最大能达到2,600×g的离心力,如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足步骤2和步骤3中的操作。

疑难解答:

RNA抽提

每1 mg组织或1×106培养细胞预期的RNA产量

1.肝和脾,6—10μg

2.肾,3—4μg

3.骨骼肌和脑组织,1—1.5μg

4.胎盘,1-4μg

5.上皮细胞(1×106 cultured cells),8—15μg

6.纤维母细胞(1×106 cultured cells),5—7μg

"抽提得率低

1.样品均化或裂解不完全。

2.终RNA不完全再溶解。

"A260/A280 比率 <1.65

1.在分光光度计测量前用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。

2.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。

3.匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。

4.分离的水样层中污染有苯酚层。

5.终RNA没有完全溶解。

"RNA降解

1.从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。

2.用于抽提的样品,或抽提的RNA样品保存于–5—–20°C,而不是存放于–60—–70°C。

3.细胞经胰酶消化而分散。

4.水溶液或试管污染有RNA酶。

5.用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林pH低于3.5。

"DNA污染

1.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。

2.用于抽提的样品包含有机溶媒(例如,乙醇,DMSO),强缓冲液,或碱性溶液。

"蛋白多糖和多糖污染

下述的对RNA沉淀方法(步骤3)的改进能从抽提的RNA中移去复合污染。以匀浆化时每1 ml TRIZOL为例,在水样层中加入0.25 ml异丙醇后再加入0.25 ml的高盐溶液(0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl)。将终溶液混匀,离心并继续进行前述的抽提操作。改进后的沉淀法能有效地析出RNA而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中。对于含有大量多糖的植物,要抽提其RNA将改进后的沉淀法和在最初匀浆化时多加一次离心(RNA 抽提指南,可选方案)合并使用是十分必要的。


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