外周血PSMA mRNA 荧光定量检测方法的建立

作者：柳建磊,秦进    作者单位：(成都铁路中心医院,四川 成都 610081)

【摘要】  目的：建立一种利用MGB-Taqman探针的快速、灵敏、特异、准确定量检测外周血PSMA mRNA的方法。方法：选择PSMA mRNA的保守区域，设计合成引物和MGB-Taqman探针，构建质粒标准品pMD18-T-PSMA，优化定量PCR反应体系，并进行方法学评价。结果：(1)成功构建了重组质粒pMD18-T- PSMA；(2)建立了利用MGB-Taqman探针的荧光定量PCR方法，其线性范围：101 copies/μl～1010 copies/μl；灵敏度：10 copies/μl；重复性：批内CV为1.4％，批间CV为2.2％，天间CV为4.9％；(3)初步临床应用证明：该方法的阳性率达到了74.3％，对PC的诊断，转移和随访都有可靠价值。结论：利用MGB-Taqman探针定量检测外周血PSMA mRNA的方法，在PC的诊断、微转移、术后随访、人群筛选中具有高度的真实性和可靠性。

【关键词】  PSMA mRNA定量检测；荧光定量PCR；MGB-Taqman探针

　　A Novel Ful-orescent Quantitative PCR Methed for PSMA mRNA

　　LIU Jian-lei,QIN Jin(Corresponding Author)

　　(Chendu Rail Central Hospital,Chengdu,Sichuan 610081,China) 
     
　　Abstract:Objective To establish a novel real-time fluorescence PCR method FOR PSMA mRNA with high sensitivity, specificity using the MGB Taqman probe.Methods The recombinant vector pMD18-T-HCV PSMA was used as the standard template. The MGB Taqman probe was designed according to the reversed sequence of PSMA. And then the PCR reaction system was optimized and evaluated.Results(1) The recombinant vector was cloned successfully.(2) Methodology analysis showed the MGB Taqman probe detecting system was well established with wide detecting range, high sensitivity, specificity.(3) When applied in clinical experiments, this novel fluorescent quantitative method has a high positive rate.Conclusion This novel real time fluorescence quantitative PCR method using MGB Taqman probe for PSMA mRNA is more sensitive and specific . PSMA mRNA is a well marker for diagnosis, identification of metastasis and  evaluation of the future result.
     
　　Key words:PSMA mRNA;Fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR);MGB Tapman probe 
 
　　近年来我国前列腺癌(prostate carcinoma，PC)的发病率呈明显上升趋势，PC及其微转移的诊断是目前倍受关注的课题，随着研究的深入，前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)引起人们的重视[1]。我们采用荧光定量PCR(real time polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测患者外周血中PSM mRNA的表达情况，探讨PSM mRNA在诊断及其微转移诊断中的意义。

　　1  材料与方法

　　1.1 标本，质粒和菌株

　　1.1.1  标本   

　　2004年4月至2005年4月，本院PC患者全血标本35例，按Jewett分期，A期：6例；B期：8例；C期：9例；D期12例，前列腺增生标本(benign prostate hyperplasia，PBH)患者全血标本20例。

　　1.1.2  pMD18-T质粒 

　　T-A克隆试剂盒，购自TAKARA公司，-20℃保存。

　　1.1.3  DH5α大肠杆菌 

　　本实验室保存。

　1.2 主要试剂与仪器  

　　Trizol购自Invitrogen公司；逆转录用M-MLV、RNasin、Buffer购自Promega公司；DEPC购自Sigma公司；无水乙醇、逆转录用dNTPs、随机引物及淋巴细胞分离液购自上海生工生物工程技术服务有限公司；PCR用Taq酶、dNTPs、Buffer、MgCl2，T-A克隆系统购自大连宝生物技术有限公司；琼脂糖、EB购自BBI公司；Marker，购自MBI公司；引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成、标记；胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司。胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术公司。PTC-200 PCR仪为Perkin Elmer产品，RG-3000为Corbett Research产品。

　1.3 探针和引物的设计、合成 

　　在genebank中查找PSMA mRNA序列，并通过BLSAT同源性比较，选择NM-001014986的一段保守序列，由上海基康生物技术有限公司设计探针和引物，经本课题组成员验证后，再由该公司合成、标记。引物序列和探针序列及标记如下，扩增片断长126 bp：
P1：5'-GATACCACATTTAGCAGGAACA-3'(498bp-519bp)；P2：5'-TTTGGGTAGGACAACAGGAC-3'(571bp-588bp)
MGB-Taqmanprobe：5'-FAM-CTCACAAATCCAGGCC-DABCYL-MGB-3'(604bp-623bp)

　　1.4 标准品质粒的构建

　　1.4.1 PSMA mRNA的提取   
 
　　取患者外周血5 ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞后故人液氯中保存。实验时，按Trizol试剂说明书提取单个核细胞RNA，用10 μl DEPC水溶解提得的RNA，取5 μl电泳，观察结果。

　　1.4.2 逆转录PCR
 
　　逆转录：总体积25 μl，其中5 μl RNA加入随机引物(0.2 μg/μl)1 μl， 70℃预变性5 min，冰上冷却，加入M-MLV逆转录酶1 μl、Rnasin 0.75 μl、dNTP(10 mM)1.25 μl、逆转录Buffer 5 μl、DEPC水11 μl，混匀后瞬时离心，在PTC-200 PCR仪上37℃，60 min，之后95℃ 5 min终止反应。
 
　　PCR扩增：逆转录产物5 μl、标准品上下游引物(5 μM)各3 μl、Buffer 3 μl、MgCl2 3 μl、dNTP 2.4 μl、Taq酶0.3 μl、水10.3 μl，循环参数为95℃预变性5 min，95℃ 40 s、62℃ 40 s、72℃ 40 s循环35次，72℃延伸5 min，PCR产物经电泳初步鉴定。

　　1.4.3 pMD18-T-PSMA构建 

　　PCR产物电泳检测后，胶回收，定量，然后克隆进T载体，转化入DH5α，用IPTG/X-gal/Amp平板（Amp浓度60 μg/ml，50 μl 24 mg/ml的IPTG 和60 μl 20 mg/ml X-gal铺板）筛选出阳性克隆，含Amp 60 μg/ml 的LB肉汤增菌，提取质粒，经酶切、PCR、测序鉴定。

　　1.5 荧光定量PCR体系和循环参数的优化 

　　为节约试剂成本，选用20 μl反应体系，模板用量5 μl，引物终浓度为：0.5 μM，分别做镁离子浓度梯度：终浓度为1.25 mM,1.9 mM,2.5 mM；探针浓度梯度：终浓度为0.25 μM，0.5 μM，0.75 μM，1.0 μM。
 
　　按以上选定的反应体系，进行循环参数的优化，我们选用两步法，即变性和退火两步循环，变性选择在93℃ 20s，退火和收集荧光信号的温度梯度如下：55℃、56℃、57℃、58℃，每一退火温度的时间梯度如下：50 s、60 s、70 s、80 s、90 s，通过荧光曲线的背景、形态、峰值、信噪比及电泳条带，判断反应体系和循环参数的优略。

　　1.6 标准曲线制作和方法学评价

　　1.6.1 标准曲线制作   

　　阳性克隆大肠杆菌在含Amp LB肉汤增菌，提取质粒，取10 μl质粒用双蒸水稀释100倍，260 nm，280 nm比色，纯度＝A260/A280, 浓度＝A260×50×2×100×10－6×6.02×1023/(2818×324.5×2) copies/ ml，根据质粒浓度，进行10倍梯度稀释，选1010copies/μl～101copies/μl十个浓度作标准品，分别以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应，所得荧光曲线，经软件处理得标准曲线。

　　1.6.2 方法学评价
 
　　(1) 线性范围：根据标准曲线的线性，维持相关系数在0.99以上，判断方法的线性范围。
 
　　(2) 重复性：批内重复性：一次检测内对一个确诊的中浓度拷贝数临床样品重复做10个平行管，定量结果计算SD和CV。批间重复性：检测一个确诊的中浓度拷贝数临床样品，一天之内重复检测10次，定量结果计算SD和CV。天间重复性：检测一个确诊的中浓度拷贝数临床样品，每天做一次，连续做10 d，定量结果计算SD和CV。
 
　　(3) 灵敏度：将质粒以10倍倍比稀释至浓度极限10 copies/μl， 用双蒸水做阴性对照，进行荧光定量反应，能区别于阴性对照的最低质粒浓度即为该法的灵敏度。
 
　　(4) 特异性：对20例PBH标本和35例PC标本进行检测，评价方法的特异性。

　　1.7 采用SAS统计软件包进行统计分析

　　2   结果

　　2.1. 标准品质粒的构建和鉴定  

　　对重组质粒pMD18-T-PSMA经过PCR、PstrⅠ和BamHⅠ双酶切初步鉴定后，再经测序鉴定，最后与Genebank中已知序列进行比较，确认获得正确克隆。

　　2.2 荧光定量PCR反应体系和循环参数  

　　经过对反应体系和循环参数的优化，最佳的荧光反应体系如下：总体积20 μl：模板5μl、P(5 μM)2 μl、P2(5 μM)2 μl、探针(5 μM)2 μl、Buffer (10×)2 μl 、dNTP (2.5 mM)1.6 μl、MgCL2(25 mM)1.5μl 、Taq酶(5U/ μl)0.2 μl 、H2O 3.7 μl；最佳循环参数：93℃ 5 min预变性，93℃ 20 s  57℃ 70s 并采集荧光信号，40个循环。

　　2.3 标准曲线和方法学评价

　　2.3.1 标准曲线 

　　7个浓度的标准品：109 copies/μl～103 copies/μl，分别做荧光定量PCR，得到的荧光曲线和标准曲线，C(copies/μl )= 10 (-0.322CT + 12.693) (见图1、图2)。

　　从左至右分别为109 copies/ μl 到103copies/ μl 七个不同浓度标准品点的荧光曲线。
 
　　由109 copies/ μl 到103copies/ μl 七个不同浓度标准品点组成的标准曲线C(copies/ μl) =  10 (-0.271 CT + 12.083)

　　2.3.2 方法学评价

　　2.3.2.1 线性范围 

　　本方法在1010copies/μl～1011copies/μl质粒浓度范围内取得了较好的线性，相关系数：0.995。

　　2.3.2.2 重复性
 
　　批内重复性结果(copies/ml)：3.65×104、3.63×104、 3.60×104、 3.54×104、3.68×104 、3.70×104、3.66×104、3.71×104、3.61×104、3.59×104，SD=533，CV＝1.4％。 
 
　　批间重复性结果(copies/ml)：4.69×104、4.80×104、4.66×104、4.72×104、4.78×104、4.59×104、4.65×104、4.86×104、4.90×104、4.61×104，SD=1054，CV＝2.2％。
 
　　天间重复性结果(copies/ml)：5.76×104、5.32×104、5.74×104、5.19×104、5.80×104、5.88×104、5.78×104、5.21×104、5.59×104、5.94×104，SD=2800，CV＝4.9％。

　　2.3.2.3 灵敏度 

　　本方法能区别于阴性对照的最低模板浓度即灵敏度为：10 copies/μl(见图3)：
 
　　从左至右分别为1010 copies/ μl 到101copies/ μl九个不同浓度标准品点的荧光曲线，黑色基线为阴性对照。
2.3.2.4 特异性   35例PC患者标本阳性结果26例(74.3％)，其中6例A期患者标本中3例阳性(50%)，8例B期患者标本中5例阳性(62.5%)，9例C期患者标本中6例阳性(66.7%)，12例D期患者标本中12例阳性(100%)，20例PBH患者标本中2例阳性(10%)，经一段时间观察，其中一例确诊为PC。可见本方法可靠的灵敏度，特异性。部分标本定量(见图4)：

　　3  讨论
    
　　PSMA是前列腺细胞膜内的一种糖蛋白，分子量为10 000道尔顿,其cDNA全长为2.65 kb， 54％的序列与人转铁蛋白受体同源，研究证实PSMA为一种转膜蛋白。PSMA在前列腺癌中具有特异性高度表达，用高灵敏度方法检测恩者外周血中PSMA mRNA表达，有助于前列腺癌的诊断、治疗及预后评价(包括判断肿瘤复发转移及进展情况等)[2]。新兴的荧光定量PCR技术，灵敏度很高，闭管操作，弥补了常规PCR的不足[3]。荧光定量PCR可采用不同的探针技术，本课题采用了很有优势的MGB-Taqman探针。该种探针在Taqman探针的一端连接一个二氢环化吲哚卟啉－三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)，DPI3呈月牙形，可通过范德华力镶嵌到探针端5个～6个bp形成的B形DNA双螺旋的小槽中，故称为小沟结合物(minor groove binder MGB)。这种结合作用能稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值，从而可简化探针的设计。MGB探针的另一个优点就是荧光背景相对于Taqman探针更低，因其长度短于Taqman，荧光报告和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，使之具有良好的信噪比，增加灵敏度[4]。
     
　　本文采用FQ-PCR检测PSMA mRNA，该方法线性范围宽，重复性好，灵敏度高，阳性率达74.3％，对PC的诊断有很大的价值，在不同分期的标本中，阳性率逐渐升高，特别是D期标本阳性率达100％，对肿瘤的扩散，转移有可靠的预示作用。对BHP的检测中，阳性率只有10％，而且其中的一例PSMA mRNA阳性的BHP患者经随访被确诊为PC，说明本方法具有很高的特异性，可以辅助临床医生进行排除诊断。
     
　　综上所述，我们建立了应用新型MGB-Taqman探针的荧光定量PCR检测PSMA mRNA的方法，该方法操作并不复杂，重复性、灵敏度、特异性均较好，而且其阳性率随PC的进展不断升高，D期PC标本阳性率可达100％，再加上荧光定量PCR技术在临床上已逐渐普及，我们所建立的方法值得向临床推荐使用。

【参考文献】
  　 [1]钟红兴.前列腺癌的中医药治疗及研究进展[J].中华实用中西医杂志,2005,18(15):604-606.
　　[2]曾浩, 李虹.前列腺膜特异性抗原的研究进展[J].国外医学外科学分册,2001,28(5):289-291.
　　[3]ackay IM, Arden KE, Nitsche A. Survey and summary real-time PCR in virology[J].Nucleic Acids Res,2002,30(6):1292-1305.
　　[4]Kutyavin I V , Afonina IV, Mills A, e t al. 3’-minor groovebinder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extensiontemperatures[J].Nucleic Acids Res,2000,28(2):655-661.