表达载体的构建是生物技术和所需蛋白质产生的基本工具，本文总结了pET-32α（+）载体技术的构建，该技术通常用于研究实验室。该方法包括获得用于构建载体的外源DNA片段，将DNA片段亚克隆到pET-32α（+）表达载体中，在大肠杆菌 BL21（DE3）中进行蛋白质表达以及在大肠杆菌中在天然条件下进行蛋白质纯化。裂解液。
介绍
作为分子生物学实验室中非常有用的实践，重组DNA技术（或基因克隆）是指将DNA片段从一种生物体转移到自我复制的遗传元件如表达载体。然后插入的DNA可以在外源宿主细胞中繁殖，或者可以表达以产生重组蛋白。pET-32α（+）载体系列用于表达与109 aa Trx•Tag™硫氧还蛋白融合的肽序列。它属于一种表达系统，可在其激活后产生所需的蛋白质。插入原核宿主细胞。原核细胞如大肠杆菌因为它们廉价，快速的生物量积累和简单的工艺规模扩大，因此是外源蛋白表达的首选宿主。
在本文中，我们将重点总结这种在我们的实验室中使用的有用技术。表达后pET-32α（+）载体的构建，蛋白质表达和蛋白质纯化将在本文中详细描述。
获得用于构建载体的外源DNA片段
插入载体的DNA通常可以使用聚合酶链式反应（PCR）从倍增基因获得，也可以来自人工合成的基因。通过PCR获得感兴趣的DNA的方法是：首先，分离含有感兴趣的DNA片段的mRNA的总RNA，并通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）将RNA逆转录成cDNA。根据公布的NCBI基因编码序列（CD）设计寡核苷酸引物，并在引物中加入指定的限制酶位点。然后，通过PCR扩增感兴趣的DNA的编码区，用凝胶提取试剂盒纯化后，将DNA片段插入克隆载体中。
通过RT-PCR将RNA逆转录成cDNA
通过PCR扩增感兴趣的DNA的编码区
经验
虽然从RT-PCR中获取DNA片段是常用的方法之一，但可能会出现许多问题并导致一些意想不到的结果，这里有一些关于如何获得高质量DNA片段的经验：在开始分离RNA的步骤中，确保所有加工步骤都应在无RNases的环境中进行，并在室温下快速充分均化样品。RNA的高纯度和完整性对于合成全长cDNA是必需的，而后者用于高质量PCR产物。除了符合设计引物的基本规则外，如果我们希望稍后表达，设计的引物必须能够将模板DNA从起始密码子扩展到终止密码子。将限制性位点引入引物的5'末端时。
故障排除
有时可能会出现低模板质量或数量，导致产量低或没有PCR产物，为避免这种情况，确保在cDNA合成之前评估RNA的完整性，并通过洗涤去除RNA纯化方案中使用的痕量试剂RNA颗粒完全含有75％乙醇。错误的PCR产物也可能由故障引物设计和次优的热循环条件引起，因此如果发生这种情况，最好重新设计引物并优化热循环条件和反应条件。不要忘记在PCR中使用高保真的热稳定DNA聚合酶，并将PCR产物暴露在紫外线下几秒钟以避免序列错误。在限制酶位于引物中之前，需要添加额外的碱基以进行有效的切割。
将DNA片段亚克隆到pET-32α（+）表达载体中
由具有指定限制性酶切位点的公司合成编码区的基因片段，其由5'末端的stat密码子（ATG）和3'末端的终止密码子（TAA，TAG或TGA）结合。然后将目的基因片段插入pMD18-T载体中以构建重组质粒，通过DNA测序鉴定。用指定的酶消化重组pMD18-T质粒，并通过以下方案将检索到的目的DNA片段亚克隆到pET-32α（+）载体中以产生重组表达载体。
将约129bp的TBO基因片段插入pET-32α（+）载体（5900bp）
用相同的限制酶在37℃消化pET-32α（+）载体和重组pMD18-T载体1小时，然后通过在65℃温育10分钟加热灭活酶。
通过凝胶提取试剂盒纯化消化的pET-32α（+）载体骨架和从pMD18-T载体切下的基因片段。
用T4 DNA连接酶在23℃下用pET-32α（+）载体骨架连接基因片段1小时，载体末端和插入末端的比例为1：3（fmol）。
将10μl连接反应与100μl感受态大肠杆菌 BL21（DE3）在冰上混合10分钟，并将混合物在42℃下孵育90秒。加入800μlLB并在37°C下孵育40分钟。涂在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB平板上。在37°C孵育过夜。
通过菌落PCR筛选插入物的存在或制备DNA并用指示限制酶消化。
通过限制酶消化鉴定插入物的存在。M：DNA标记，1：用BamHI / SalI消化后的重组pET-32α（+）载体
经验
有时通过PCR仍然难以获得DNA产物，因为引物被定义为具有起始密码子和终止密码子的有限区域，因此人工合成所需的基因是获得DNA片段的替代选择。根据我们的经验，表达载体很大或具有低拷贝数，因此更有效的方法是首先将DNA片段克隆到非表达载体中，然后将其亚克隆到表达载体中。确保在感受态细胞中设置没有载体的阴性对照和在转化期间在大肠杆菌细胞中单独使用空载体的阳性对照。
故障排除
1.低产量或无转化体：原因可能是感受态大肠杆菌细胞的转化效率非常低，因此在转化前用空载体DNA检查转化效率。用于转化的过量的连接混合物或用于连接的过量的连接酶也可能导致该问题。在转化之前，确保DNA片段不含有污染物（例如，过量的盐，EDTA，蛋白质，苯酚等），并在结扎前适当地用正确的限制酶消化。2.没有插入的空载体：这可能是由载体再循环或不完全载体切割引起的，试图使载体去磷酸化并检查琼脂糖凝胶上的切割效率可能有助于您解决这个问题。3.插入序列错误：PCR引物中的错误和PCR中使用的低保真DNA聚合酶可能会导致此问题。
大肠杆菌 BL21（DE3）中的蛋白质表达
重组pET-32α（+）载体可以表达所需的蛋白质，其在被异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后与大肠杆菌 BL21（DE3）中的109aa Trx•Tag TM融合。首先，将含有100μg/ ml氨苄青霉素的10ml LB培养基与含有重组pET-32α（+）载体的新鲜细菌菌落一起接种37℃过夜; 然后，将500-μl过夜培养物加入到含有100-μg/ ml氨苄青霉素的30-ml新鲜LB培养基中，在37℃接种直至OD 600 = 0.6。加入IPTG至终浓度为1 mM，在200转/分钟的振荡器中将培养物在32℃培养5小时之后，通过以4000g离心15分钟收获细胞。为了鉴定融合蛋白在细胞中的表达，首先，在IPTG诱导之前和之后收集一部分细胞，以4000g离心15分钟，然后用PBS重悬沉淀并在冰上超声处理，收集上清液。分别和沉淀，并通过SDS-PAGE凝胶分析。
接种大肠杆菌 BL21用于蛋白质表达
IPTG诱导的融合蛋白的SDS-PAGE分析。通过SDS-PAGE分离蛋白质并用考马斯亮蓝染色。泳道1：蛋白质分子量标记; 泳道2：未诱导的BL-21 / pET32a（+）/ pTBO超声处理后的上清液; 泳道3：诱导BL-21 / pET 32a（+）/ pTBO超声处理后沉淀; 泳道4：BL-21 / pET 32a（+）/ pTBO超声处理诱导5小时后的上清液。pTBO融合蛋白的分子量约为22kDa。
经验
对于原核物种中的异源蛋白质表达，首先，我们需要优化通常用于大肠杆菌的密码子。其次，在培养基中加入IPTG后，让培养物生长不同的时间点，如3小时，6小时，12小时18小时，并在37°C，30°C，21°C或不同的温度下尝试不同的温度。在18°C，选择优化的蛋白质表达条件，这可能会增加表达蛋白质的溶解度。
故障排除
尝试较低的生长温度和较低的诱导剂浓度可以避免包涵体的形成，并有助于一些不正确的二硫键形成和疏水蛋白的情况。为了保护蛋白质，我们可以在培养后向培养基中加入蛋白酶抑制剂，并在冰上破碎细胞以避免降解。
在大肠杆菌裂解物中在天然条件下的蛋白质纯化
Trx•Tag™是移植到重组蛋白上的肽序列，可以通过肠激酶去除。这种蛋白质标签是一种增稠标签，可以帮助蛋白质正确折叠并防止它们沉淀。由重组pET-32α（+）载体表达的融合蛋白也含有经常用于亲和纯化的His-Tag，该His-Tag也可用于通过蛋白质印迹纯化后鉴定融合蛋白。以下是通过Ni-NTA旋转试剂盒（QIAGEN）在天然条件下纯化蛋白质的方法。
蛋白质印迹分析融合蛋白的表达。在大肠杆菌 BL21菌株中表达TBO的融合蛋白，经NI-NTA旋转试剂盒纯化后，使用抗His标签抗体通过Western印迹分析蛋白质。Trx。Tag + TBO为22 KDa
将来自5-ml培养体积的沉淀重悬于630μl裂解缓冲液（NPI-10）中，在冰上以30秒的间隔超声处理细胞悬浮液10秒短暂10秒。
在4℃下以12,000g离心裂解物20分钟并收集上清液。
用600μl缓冲液NPI-10平衡Ni-NTA离心柱，以890g离心2分钟。
将含有6×His标记蛋白的600-μl裂解液加载到预平衡的Ni-NTA离心柱上，以270 g离心5分钟并收集流通液
用600μl缓冲液NPI-20洗涤Ni-NTA离心柱三次，以890g离心2分钟。
用300μl缓冲液NPI-500洗脱蛋白质两次，以890g离心2分钟并收集洗脱液。
经验
如果缓冲液中的固体颗粒阻塞旋转柱，则应首先过滤该方案中使用的所有缓冲液，并确保缓冲液含有精确浓度的咪唑。不要忘记在每个步骤中收集流通液，这样您就可以检查洗脱液中洗脱的蛋白质类型。NI-NTA旋转柱是可重复使用的，这意味着在NPI-10再次平衡后，旋转柱可以使用两到三次。
故障排除
蛋白质不与NI-NTA离心柱结合：首先，这可能是由于错误的结合条件引起的，例如缓冲液中pH值较低和咪唑浓度较高。其次，6×His标签在蛋白质中不存在或不可接近，因此如果缓冲液中的咪唑的pH值和浓度正确，则应再次检查表达构建。
蛋白质在洗涤缓冲液中洗脱：这可能是因为洗涤严格性太高或错误的缓冲条件，对于这个问题，降低咪唑浓度或略微增加pH值有时可能有所帮助。
纯化过程中蛋白质沉淀：这将在环境温度过低时发生，因此在室温下进行纯化可能比将其置于冰上更好。
总之，作为一种广泛使用的生物技术，用于蛋白质在大肠杆菌中表达和纯化的pET-32α（+）载体的构建是快速，廉价和可扩展的。虽然作为原核系统，与真核表达系统相比，它也有其缺点。蛋白质的性质是多种多样的，很难判断目标蛋白质是否能够表达，溶解，具有活性和结晶。因此，包括载体和宿主在内的表达策略的选择应根据蛋白质的量，纯度和活性的要求。
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