黏粒文库的扩增和贮存(在液体培养基内扩增)

λ 噬菌体包装反应 大肠杆菌接种菌株

甘油

卡那霉素的琼脂平板 TB 培养基 Sorvall GSA 转头或同类产品 冻存管

一、材料

1. 缓冲液与溶液

甘油

2. 培养基

含 25 μg/ml 卡那霉素的琼脂平板

TB 培养基

含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养基

3. 离心机与转头

Sorvall GSA 转头或同类产品

4. 专用设备

冻存管

5. 载体及菌株

λ 噬菌体包装反应

适宜的大肠杆菌接种菌株（如 XLl-Blue、ED8767、NM554、DH5αMCR)

二、方法

预培养

1. 计算能产生 3 万~ 5 万个转化菌落的包装反应体积。

2. 取若干无菌试管，在每管中加入 0.2 ml 接种细菌，接着加入包装反应液并使其达到步骤 1 确定的体积。

3. 将试管在 37℃ 温育 20 min。

4. 各管中分别加入 0.5 ml TB, 继续温育 45 min。

在含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养基中扩增

5. 分别取 0.25 ml 各种感染的细胞，接种于 100 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养基 中，置于 250 ml 培养瓶。

6. 37℃ 剧烈振摇培养，使细胞密度至 OD₆₀₀=0.5~1.0。

7. 合并所得培养物，5000 g ( 5500 r/min，Sorvall GSA 转头）4℃ 离心 10 min，回收细胞，再用 1/10 原体积的 TB 重悬细胞。

8. 向细胞悬液中加入无菌甘油至终浓度为 15% (V/V)。颠倒封好口的试管数次，充分混匀悬液。将细菌悬液以 0.5~1.0 ml 的体积分装于数个无菌管，封好管口，-70℃ 保存。

9. 进行筛选时，于 37℃ 迅速融化一小份冻存细胞，按毎张膜 3 万~ 5 万个细菌的密度铺到编好号码的滤膜上。在影印滤膜上裂解菌落，然后将滤膜与标记探针杂交。