实验方法原理 | 靶基因经 PCR 扩增,样品进行必要的纯化回收后,接下来用平末端进行连接克隆也是分子生物学实验中常规采用的技术路线,实验一般利用噬菌体 T4 DNA 聚合酶等补平扩增 DNA 片段的末端(Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。Liu 与 Schwartz (1992) 发现在连接反应的温育过程中,当反应液中存在过量的限制性内切核酸酶能显著地增加重组质粒的产率。这种内切核酸酶的作用在于切割环状的和线性的串联体,而 这种内部的酶切位点是由质粒分子自连产生的。这种方法要求靶 DNA 分子与载体的连接消除其限制性酶切位点。在这个过程中还必须防止内切酶消化连接反应产生的重组子。在连接反应中,单位长度的线性载体分子不断产生(或再 生)的净效应将驱使连接反应的平衡态向有利于载体与插入片段连接产生重组子的方向进展。 |
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实验材料 | 噬菌体 T4 DNA 连接酶 噬菌体 T4 DNA 聚合酶 限制性内切核酸酶 闭环质粒 DNA 靶基因 DNA |
试剂、试剂盒 | ATP dNTP 溶液 KGB 广域缓冲液 |
仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶 水浴箱 |
实验步骤 |
一、材料 展开 |