按下一步骤的要求重溶解沉淀物。
二、cDNA 的合成
1.加入 10ul 经 DEPC 处理水重溶 RNA 沉淀物，加入 1ul（10ug）T7digo（dT)18。
2.95℃ 水浴 2 min 使 RNA 变性，在冰上快速冷却。
3.加以下物质：
4.37℃ 温育 lh。
5.加以下物质：
6.16℃ 水浴温育 2 h。
7.按上述 RNA 的分离第 7~19 步进行酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提以及乙醇沉淀。
8.加入 10ul 水重溶双链 cDNA 沉淀物，用 50 ml TE 液（无 RNA 酶）透析 4 h(温和地将 cDNA 转移到
0.025um 微孔滤器上，滤器浮于含 50 ml 无 RNA 酶 TE 液的锥形管中。4 h 后将样本转移到 1.5 ml 的反应管中，用 5
经 DEPC 处理过水漂洗滤器，并将洗液加入同一管中)。
三、aRNA 的合成
1.每 15.2ul 上述步骤所得双链 cDNA 溶液中加入以下物质：
2.37℃ 温育 4 h。
3.加入以下物质：
4.37°C 温育 30 min。
5.按上述 RNA 的分离第 7~19 步进行酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提以及乙醇沉淀。
四、从 aRNA 合成 cDNA
1.加入 10ul 经 DEPC 处理水重溶 aRNA 沉淀物, 然后加入 1ul(10ng) 六核酸引物。
2.95°C 水浴 2 min 使 aRNA 变性，在冰上决速冷却。
3.加以下物质：
4.37℃ 温育 lh。
5.按上述 RNA 的分离的第 7~19 步进行酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提以及乙醇沉淀。
6.按上述 cDNA 的合成的第 8 步进行透析。
7.把 cDNA 转移到干净的反应管后，加入经 DEPC 处理水至终体积 50ul。
五、DD-PCR
1.在 0.5 ml 反应管中加入以下物质：
2.当所用的热循环仪没有预热顶盖时，可以在反应管中加一滴植物油，以防止水分蒸发。
3.将反应管放入预先加热到 94℃ 的热循环仪，进行 PCR 前先温育 3 min。
4.循环 40 次。
5.加 8pd 甲酰胺加样缓冲液，94°C,5 min 使 DNA 变性。
6.5% 变性聚丙烯酰胺测序凝胶电泳，每孔加样 6ul 走胶，直至二甲苯青 FF 达凝胶全长的 3/4 处。
7.用塑料薄片覆盖湿凝胶，无须固定，放射自显影过夜，用荧光墨水标记凝胶四角。
8.利用突光点作为标志物准确排列经曝光胶片和凝胶，切下目的胶条，放入干净的 1.5 ml 反应管中。
9.每个胶条中加 500 凝胶洗脱缓冲液，95℃ 水浴 10 min, 室温放置 16 h。
10.取 200ul 含目的 PCR 产物的凝胶洗脱缓冲液，加入干净的 1.5 ml 反应管中，加 1ul(10ul）的糖原，按上述 RNA 的分离第 7~19 步沉淀 DNA。
11.用 10ul 经 DEPC 处理水重溶 DNA 沉淀物。PCR 产物此时可在-20°C 储存，小部分样品（如 1~3ul)
可用于重新扩增（引物同 DD-PCR 反应）以及随后克隆或测序。重新扩增时 PCR 循环的次数严格根据初始 PCR
产物从聚丙烯酰凝胶中的回收率而定。一般来说，20~40 个循环可以获得足够的产物用于后续的克隆。我们推荐使用市售试剂盒来直接克隆经重新扩增的
PCR 产物，如 Invitrogen 公司的 TOPOTA 克隆试剂盒。
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