M13模板
双链模板
实验材料 | mRNA |
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试剂、试剂盒 | 琼脂糖 电泳缓冲液 ATP 寡聚核苷酸引物 多核苷酸激酶缓冲液 T4 |
仪器、耗材 | 离心机 分光光度计 摇床 |
实验步骤 |
一、图片简介
1. 用1×碱性制胶缓冲液制备1.2%的低融点琼脂糖,并将凝固好的胶在1×碱性电泳缓冲液中浸泡过夜。
2. 将以下试剂混合以制备磷酰化的寡聚核苷酸:
4. 加入9 μl 4 mmol/l dNTP混合液和2 μl klenow酶,37℃保温30 min 以延伸寡核苷酸模板,65℃加热5 min 灭活klenow酶后置于冰浴。
6. 加入100 μl 5mol/l 乙酸铵和500 μl 乙醇,-20℃沉淀过夜或干冰/乙醇中放置15 min,在微量离心机中离心15 min,晾干沉淀。
9. 将切下的凝胶移入一个微量离心管中,65℃融化,确定体积后,加入等体积的TE缓冲液,再在65℃保温10 min。
12. 在不多于50 μg RNA中加入5×104切伦科夫计数的探针,调整最终体枳为100 μl,盐浓度为0.3 mol/l 乙酸钠,加入250 μl 乙醇沉淀。
16. 加1 ml 无水乙醇,沉淀。以70%乙醇冼沉淀,在Speedvac蒸发器中干燥5 min。
18. 按下面的提示制备合适浓度的聚丙烯酰胺/尿素凝胶。
19. 在凝胶上加样3~5 μl 进行分析,凝胶放射自显影后确定标记DNA片段的大小。
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