外无细胞体系翻译病毒 mRNA

HEPES-KOH Tris-HCl 等渗溶液 低渗溶液 10X 盐溶液 裂解溶液 磷酸肌酸   尚铁血红素 亚精胺 EGTA DNaseI LiC1 沉淀溶液 TE S10 翻泽混合物 [32S]Met 电泳缓冲液L 2X 上样缓冲液 凝胶固定液

高速离心机 Dounce 匀浆器 SDS 凝胶电泳装置

―、材料与设备

(一）细胞

1)HeLaS3 细胞在含 5% 新生牛血清 (NCS) 和 0.15%NaHCO₃ 的 RPMI1640 培养基中于 37℃ 转瓶培养，每天进行细胞传代以维持细胞密度为每毫升 2〜5X10⁵ 个细胞

2)TgSVA 细胞来源于表达脊髓灰质炎病毒受体的转基因小鼠肾，用含 5% 胎牛血清和 0.15%NaHCO3 的 DMEM 培养基维持单层培养

3)Lx 细胞来源于表达人脊髓灰质炎病毒受体的 Ltk 细胞，用含 5% 胎牛血清、10⁴mol/L 次黄嘌呤、4×10^-3mol/L 氨基嘌呤，8×10^-4mol/L 胸腺嘧啶脱氧核苷和 0.15%NaHCO₃ 的 DMEM 培养基维持单层培养

4)NS20Y 细胞 (鼠成神经细胞瘤）在含 10% 胎牛血清和 0.15%NaHCO₃ 的高糖 DMKM 培养基中维持培养

5) 人肝癌来源的 HepG2 细胞用含 10% 胎牛血清和 15%NaHCO₃ 的 DMEM 培养基培养。

(二）制备 S10 抽提物

所用试剂和水均无 RNase，耗材为一次性使用

1)lmol/LHEPES-KOH(PH7.5)，高压灭菌，室温保存

2)lmol/LTris-HCl(pH7.5), 高压灭菌，室温保存

3) 等渗溶液：35 mmol/LHEFESKOH(pH7.5)，146 mmol/LNaCl，11 mmol/L 葡萄糖。高压灭菌，4℃ 保存

4) 低渗溶液：l0 mmol/LHEPES-KOH(pH7.5)，15 mmol/LKC1，1.5 mmol/LMgAC₂，6 mmol/L 巯基乙醇,-20℃ 保存

5)10X 盐溶液：200 mmol/LHEPESKOH(pH7.5)，1.2mol/LKC1，50 mmol/LMgAc₂,6 mmol/L 疏基乙醇。-20℃ 保存

6) 裂解溶液：l0 mmol/LHEPES-KOH(pH7.5)，120 mmol/LKC1，1.5 mmol/LMgAc₂，lmmol/L 二硫苏糖醇-

7)0.2mol/L 磷酸肌酸 (CP): 磷酸肌酸溶于无 RNase 的水中，按 0.2〜0.3 ml 分装，一 20°C 保存

8)10 mg/ml 肌酸磷酸激酶 (CPK):CPK 溶于 20 mmol/LHEPES,pH7.5 和 50% 甘油溶液中，按 0.2rnl 分装，一 20℃ 保存

9)15OOOU/ml 核酸酶：lml 无 RNase 的水中溶解 15000U(=0.667 mg) 核酸酶 S1，—20℃ 保存

10)15 mg/mltRNA: 溶解 ISmgtRNA 在 lml 水中，酚抽提数次，乙醇沉淀。再用无 RNase 的水溶解沉淀，浓度为 15 mg/ml，—20℃ 保存

11)lmmol/L 尚铁血红素：6.5 mg 高铁血红紊溶解在 0.5 ml1mol/LKOH，加 0.5 mLTris-HCl(pH7.5)，用 lmol/LHCl 调至 ph7.8，加 8.5 ml 己二醇。18000 g 离心 5 min，收集上清，一 20°C 保存

12)l00 mmol/L 亚精胺：溶解在无 RNase 的水中，一 20℃ 保存。

13)0.2mol/LEGTA: 溶解在无 RNase 的水中，用 5mol/LKOH 调整至 PH7.5 ,4℃ 保存

14)20 mmol/LATP: 溶解 122 mgATP 在 10 ml 无 RNasc 的水中，用 lmol/LNaOH调整至 pH7.0, 按 0.2〜0.5 ml 分装于—20℃ 保存

15)20 mmol/LGTP: 溶解 96 mgGTP 在 10 ml 无 RNase 的水中，用 lmol/LNaOH 调整至 pH7.0, 按 0.2〜0.5 ml 分装，一 20℃ 保存

16) 高速离心机。

17)Dounce 匀浆器。

(二）体外转录

1) 质粒 DNA: 包含 T7 或 T3 启动子的质粒 DNA 和来源于脊髓灰质炎病毒或 HCV 的 IRES。

2)DNaseI: 无 RNase 的 DNaseI(2U/ul)。

3)LiC1 沉淀溶液：7.5mol/L，LiC1，50 mmol/LEDTA。

4)TE：10 mmol/LTris-HCl(pH7.6),lmmol/LEDTA

(四）体外翻译

1)S10 翻泽混合物；4ul0.5mol/LHEPESKOH(pH7.5),26UL15mol/LKAc，0.8ulMgAc2,50ul20 mmol/LATP,2.7UL20mmol/LGTP，45ul0.2mol/LCP.2ul1mol/LDTT,2ul0.1mol/L 亚精胺，11ullmmol/L 氨基酸混合物 (无甲硫氨酸）。加无 RNase 的水至 I8Oul,30〜50ul 分装，一 80℃ 保存

2)[32S]Met:10mCi/ml 的 [32S]Met(120Ci/mmol)(翻译级），一 80℃ 保存

3) 肌酸磷酸激酶（CPK):0.5ug/ul 的 CPK，用 10 mg/mlCPK 和无 RNase 的水新鲜配制

4)SDS 凝胶电泳装置

5)10%SDS 胶：9.8% 丙烯酰胺，0.2% 亚甲双丙烯酰胺，1%SDS，0.375mol/LTris-HCl(pH8.8)

6) 电泳缓冲液：3 gTris 碱，14.4 g 甘氨酸，lgSDS，加水至 1L

7)2X 上样缓冲液：100 mmol/：LTris-HCKpH6.8),200 mmol/LDTT，4%SDS，0.2% 溴酚蓝，20% 甘油

8）凝胶固定液:50% 甲醇，10%HAc 溶在水中。


二、操作方法

(-）体外翻译抽提物的制备

1. 未感染的 HeLa 细胞

除非特殊说明，所有的步骤均须在 0〜4℃ 进行。

1) 用低温离心机于 300 g 离心 7 min, 收集大于 2L 的悬浮培养液中的 HeLa 细胞

2) 等渗溶液洗 3 次。此后步骤感染的与未感染的 HeLa 细胞一样。

3) 在小体积等渗溶液中重悬细胞，并转移至一带刻度的锥形离心管中

4) 于 300 g 离心而后调整细胞密度至 2X10⁹/7〜8 ml，重悬细胞于 1.5 倍细胞体积（10 ml) 的低渗溶液中，(TC 静置 10 min)

5) 冰冷的 Dounce 匀浆器匀浆 50 次，显微镜下检査匀浆物屮细胞是否完全裂解。

6) 加 5/18 体积的 10X 盐溶液，18000g 离心弃去沉淀沉淀包含细胞核、线粒体、膜结构样细胞组分），上清即为粗制的 S10 抽提物

7) 加入 ATP 至终浓度为 lmmol/L, 加入 GTP 至终浓度为 0.2nnnol/L, 加入 CP 至终浓度为 8 mmol/L, 加入 CPK 至终浓度(0.2mg/ml, 于 37℃C 温育 30 min, 以除去核糖体上结合的内源 mRNA。

8)100 倍体积的裂解溶液于 4°C 温育 lh, 或者将抽提物过 G-25 柱以代替裂解。

9) 如果 S10 抽提物变得浑浊，于 6600 g 离心 5 min，收集乳白色上清进行以下步骤。

10) 将 0.2 mllmmol/L 高铁血红素，50ul10 mg/mlCPK，0,lml0.1mol/LCaCl2,0.lml15000U/ml 核酸酶 S7 于 15〜20℃ 温育 5〜15 min, 以破坏内源 mRNA

11) 加入 0.lml0.2mol/LEGTA,40uL15 mg/mltRNA 将停止核酸酶反应。如果必要，于 6600 g 离心 5 min，0.2〜0.3 ml 分装冻存于-80℃

2. 脊髄灰质炎病毒感染的 HeLa 细胞

1) 收集 HeLa 细胞（5L,2X10⁹ 个细胞），悬浮在 1/20 体积（250 ml) 的无血清 RPM11640 中。

2) 感染脊髓灰质炎病毒，感染复数 MOI 为 20(4Xl0¹⁰pfu）（pfu 空斑形成单位）

3) 室温吸收 20 min，然后 37°C 温育 40 min

4) 加 3 倍体积（750 ml) 包含 7.5%NCS 的 RPMI1640。在转瓶中 37℃ 温育感染细胞 4 h。以下制备 S10 的方法同未感染病毒的 Hela 细胞。

3. 感染和非感染的单层细胞

1) 用来制备 S10 抽提物的单层细胞（TgSVA、Lx、NS20Y 和 HepG2) 的生长状态应保持良好。经 0.02mol/LEDTA 和 0.1% 胰蛋白酶消化后，从 60〜100 个培养皿 (直径 150 mm) 中收集 2X109 个细胞，悬浮在含血清的 DMEM 培养液中在转瓶中继续培养 5〜8 h。

2) 如果要感染脊髓灰质炎病毒，加入病毒感染复数 MOI 为 20 并在悬浮培养液中培养 5 h, 吸收方法同 HeLa 细胞。

3) 感染后在悬浮培养液屮继续培养 4 h，准备 S10 柚提物方法同 HeLa 细胞。

(二）体外 RNA 合成

1) 合适的内切酶线性化基因，酚：氯仿纯化。DNA 片段不必进行分离，通过标准的体外转朵方法制备转录子，或采用商品化试剂盒制备。

2)RNA 被转录后消化模板 DNA，加入 1U/样品的无 RNase 的 DNaseI 于 37℃ 温育 15 min

3) 加入 1/2 体积的 7.5mol/L LiCl，一 20℃ 放置 30 min。

4)10000 g 离心 10 min，用 80% 乙醇洗 RNA 沉淀，风干沉淀并溶于 0.5 ml 无 RNase的 TE(终浓度 1ug/ul)。通常 1ug 模板 DNA 对转录 5o〜100ugRNA，按 10〜20ul 分装并储存于-80℃

5) 通过琼脂糖凝胶电泳分析 RNA 产物大小，分光光度计分析产量。

(三）无细胞翻译

储存于一 8O℃ 的 S10 抽提物只能冻融一次，而 11 对于每一个抽提物和每一个 mRNA，其合适的 K⁺,Mg²⁺离子浓度是不同的。

1) 将所冇的组分加至管中，最终反应包含 20ul(或 l0 ul)SlO 翻泽混合物和 RNA 模板，加无 RNase 的水至终体积 25ul(或 12.5ul)

例如，脊髓灰质炎病毒 mRNA 在 HeLaS10 屮的反应混合物：13.5ulS10,4.5ul 翻译混合物，1ul0.5ug/uLCPK,0.1ulRNasin，0.5uCi[32S]Met, 模板 RNA(0.5ug），加无 RNasin 水至 25ul, 每个试剂的终浓度为：1.0 mmol/LATP,57umol/LGTP，9 mmol/L 酸肌酸 (CP)，0.02ug/ul 肌酸磷酸激酶 (CPK),2 mmol/LDTT，0.2 mmol/L 亚精胺，20 mmol/LHEPES,120 mmol/L(HCVmRNA 是 150 mmol/L)KAc,0,8 mmol/L(HCVmRNA 是 1.5 mmol/L)MgAc2，19 种氨基酸每种 60umol/L，0.5pCi[32S]Met 和 0.5ugRNA

2) 于 30〜32°C 温育 (通常为 60 min)，加样品缓冲液至翻译混合物，煮沸 2 min，10%SDS-PAGE 分析。

3) 如果必要，在曝光时可采用放射性自显影增感屏 (autoradiographyenhancer)。

1)S10 和 S100 分別是将细胞质于 18000 g 离心和 100000 g 离心 20 minn 所获得的上清。

2) 应采用无 RNase 的和高等级的试剂, 玻璃器皿用 2mpL/LNaOH 洗 3 次或浸泡在0.05moL/LNaOH 中过夜，然后用新鲜的去离子水完全漂洗。

3) 高铁血红素用来阻止 elF2α的磷酸化，应仔细调整 pH 且应无 RNaSe。

4) 自 TgSVA 细胞制备 S10 抽提物，需匀浆 80 次以上以裂解细胞。细胞匀浆物制备随细胞类型而异。

5) 核酸酶处理会降低 S10 抽提物的活性。EGTA 和 Ca²⁺的浓度，温育时间（5〜l5 min) 和温度（15〜20°C) 都是非常重要的，EGTA 和 CaCl₂ 浓度的不合理常常是失败的主要原因，因为游离的钙将允许核酸酶保侍活性。

6) 生长状态良好的细胞对于冇效制备 S10 抽提物至关重要，对于单层细胞可釆用胰酶消化，再转至转瓶中继续培养 5〜8 h

7) 制备有活性的 S10 抽提物成功率为 70%，从感染病毒的 HeLa 细胞中制备 S10 抽提物成功率比较高，从非感染的单层细胞制备冇翻译活性的抽提物成功率则只有 30%〜50%.

8) 在无细胞翻译体系中，K⁺,Mg²⁺离子浓度随抽提物和 mRNA 的种类而变。例如：在 HeLaS10 中，对于脊髓灰质炎病毒 mRNA 采用 100 mmol/LK⁺和 0,8 mmol/LMg²⁺, 而对于 HCV 病毒 mRNA 则采用 176 mmol/LK⁺和 1.6 mmol/LMg²⁺，此时合适的脊髓灰质炎病毒 mRNA 的量为 0.5ug