通过高等真核生物无细胞提取物分析mRNA的降解实验

DEPC 细胞 多聚核糖体 RNA底物

乙酸钾 乙酸镁 DTT Tris-乙酸 组织培养液 无菌去离子水 磷酸肌酸 ATP GTP 乙酸钾 精胺 RNase 抑制剂

高温烤箱 匀浆器 研杵 低速离心机 超速离心机 转头 离心管 单面刀片 磁力搅拌器 搅拌子

一、材料与设备

1. DEPC 处理玻璃器皿

(1) DEPC。

(2) 高温烤箱。

2. 从指数生长的组织培养细胞制备多聚核糖体和多聚核糖体后上清 S130

(1) 指数生长期的组织培养细胞。

(2) 溶液 A : 1 mmol/L 乙酸钾，2 mmol/L 乙酸镁，2  mmol/L DTT，10 mmol/L Tris-乙酸（pH 7.6），室温保存。

(3) 溶液 B : 添加了 30% ( m/V ) 无 RNase 蔗糖的溶液 A，消毒灭菌。

(4) 无血清和抗生素的组织培养液。

(5) 清洁的带 Teflon 研杵的 Potte-Elvelijem 匀浆器，其槌管间隙（elearance）近 0.1 mm。

(6) 1 ml 或 2 ml Dounce 玻璃匀架器配紧型研杵，其槌管间隙 0.06 mm。

(7) 低速离心机、超速离心机及合适的转头和离心管。

(8) 单面刀片。

3. 从多聚核糖体制备 RSW

(1) 分离的多聚核糖体，步骤2 “从指数生长的组织培养细胞制备多聚梭核糖体和多聚核糖体后上清 S130”。

(2) 溶液 A、B 及超速离心机。

(3) DEPC。

(4) 磁力搅拌器和搅拌子。

(5) 4.0 mol/L 乙酸钾。

4. 内源性多聚核糖体 mRNA 的降解

(1) 溶液 C : 200 μl 无菌去离子水，200 μl 1.0 mol/L 磷酸肌酸，40 μl 1 mol/L DTT，100 μl 0.2 mol/L ATP（Tris 盐），20 μl 0.2 mol/L GTP ( Tris 盐），1 ml 2.0 mol/L 乙酸钾， 800 μl 2.5 mmol/L 精胺，200 μl 1.0 mol/L Tris-乙酸（pH 7.5 )。分装为 0.2~0.4 ml，储存 -70℃。

(2) 溶液 A 和浓度为每毫升 10⁶ 细胞的来源多聚核糖体。

(3) 溶液 D：1 μl 去离子无菌水，3.2 μl 溶液C，0.25 μl 4 mg/ml 肌酸激酶，0.25 μl 40 U/μl RNase 抑制剂。16 μl 溶液 A，0.2 μl  0.1 mol/L 乙酸镁。用前于冰上配置，每个反应为 25 μl。

5. 用多聚核糖体作为 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解

(1) 溶液 A 和浓度为每毫升10⁶ 个细胞来源的多聚核糖体。

(2) 溶液 C 。

(3) ³²P 标记（10⁷cpm/μg，5000~20000 cpm/μl 水溶液）和未标记的 RNA 底物  ( 0.1~2.0 μg/μl 水溶液）。

(4) 溶液 E : 3.2 μl 溶液 C，0.25 μl 4 mg/ml 肌酸激酶，025 μl 40 U/μl RNase 抑制剂，16 μl 溶液 A，0.2 μl 0.1 mol/L 乙酸镁和 1.1 μl RNA 底物，用前于冰上配置，每个反应 25 μl。

6. 用 RSW 作为 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解

(1) 溶液 A 同操作程序3 “从指数生长的组织培养细胞制备多聚核糖体后上清 S130” 中的步骤 (2)。

(2) RNA 底物同操作程序5 “用多聚核糖体作为 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解”。

(3) RSW（ribosomal salt wash）见操作程序3 “从多聚核糖体制备 RSW”。

(4) 溶液 F : 1.2 ml 无菌去离子水，200 μl 1.0 mol/L 磷酸肌酸，40 μl 1.0 mol/L DTT，100 μl 0.2 mol/L ATP ( Tris 盐），20 μl 0.2 mol/L GTP ( Tris 盐），800 μl 2.5 mmol/L 精胺，200 μl 1.0 mol/L Tris-乙酸（pH 7.5 )，0.2~0.4 ml 分装，储存于 -70℃。

(5) 溶液 G，每个反应 25 μl 用前于冰上配置：3.2 μl 溶液 F，0.25 μl 4 mg/ml 肌酸激酶，0. 25 μl KNase 抑制剂，15 μl 溶液A，0.2 μl 0.1 mol/L 乙酸镁和 1.1 μl RNA 底物。

7. 用 mRNA 依赖的兔网织红细胞翻译系统作为 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解

(1) 微球菌核酸酶预处理的商品化兔网织红细胞。

(2) 细胞来源或体外转录来源的 mRNA 溶解在无 RNase 无菌水中，浓度 0.1~5.0 μg/μl。

(3) 胎盘或重组的 RNase 抑制剂（40 U/μl）。

(4) 1 mmol/L 氨基酸混合物。

(5) 放射性标记的氨基酸（可选）。

二、操作程序

1. DEPC 处理玻璃器皿

(1) 在每一个玻璃器皿中加入少量的 DEPC 溶液。

(2) 转动玻璃器皿使其所有的内表面都接触到 DEPC。

(3) 倒掉 DEPC，用无菌的去离子水彻底冲洗直至明显的 DEPC 味完全消除，至少要清洗 10 次。

(4) 用铝箔覆盖玻璃器皿，于烤箱烘烤至少 1 h，最好过夜。

2. 从指数生长组织培养细胞制备多聚核糖体和多聚核糖体后上清 S130

(1) 细胞计数。

(2) 于 4℃，500 r/min 离心 4 min，离心转子的水平半径为 8 cm。

(3) 吸弃上清。

(4) 用无血清与抗生素的组织培养液温和地重悬细胞。

(5) 离心同步骤 (2)。

(6) 用溶液 A 重悬细胞。

(7) 将细胞转移至预冷的 Potter-Elvehjcm 匀浆器中。

(5) 将匀浆器置于冰水浴中，快速上下移动并同时左右拧动研杵以研碎细胞。

(9) 将匀浆物以 8300 g 离心 10 min（相当于 9000 r/min），离心转子的半径为 9.1 cm。

(10) 小心地吸出上清（S8），避免带出任何沉淀物（细胞核及膜），最后在离心管中剩下少量的上清以避免 S8 中污染有沉淀成分。

(11) 在预冷的超速离心管中加入约 25% 的溶液 B，将 S8 小心地铺在溶液 B 上。如果 S8 上清的量不够就加入溶液 A。

(12) 2℃，130000 g 离心 2.5 h。如果要收集 S130 上清的话，在离心结束后要求不开制动而自动减速。

(13) 回收蔗糖溶液上面的 S130 上清，应小心以防止收集到蔗糖溶液顶部的白色物质，如果必要的话，最后在离心管中剩下少量的上清不吸出。不用担心离心管顶端的一些白色的黏稠液体是否会随着 S130 一起被回收。将回收的 S130 保存在预冷的离心管中。

(14) 吸弃离心管中剩余的液体，包括蔗糖溶液。在管子的底部中央可见淡蓝白色的多聚核糖体沉淀。

(15) 在冷室中用刀片在距离心管顶部近 2/3 的地方切开，弃顶部。

(16) 在余下的离心管底部温和加入约 1 ml 溶液 A，轻轻来回移动管子洗去残留液体包括蔗糖，吸弃液体。

(17) 审复清洗过程，此操作无须太快，因为多聚核糖体不会溶解在洗液中，但应小心缓慢的加入液体以避免使多聚核糖体沉淀从离心管底部脱离。

(18) 用小体积的溶液 A 重悬多聚核糖体沉淀，溶液 A 的体积依赖于多聚核糖体的量和后续的实验需要，一般每 10⁵ 个细胞来源的多聚核糖体重悬在 1 μl 溶液中。

(19) 采用分光光度计以 260 nm 和 280 nm 波长检测多聚核糖体和 S130 的光密度值， 分装成 100~200 μl 并储存于 -70℃。

(20) 可以取一小部分制备物回收 RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析制备的多聚核糖体的完整性。rRNA可以通过 EB 染色进行观察，如果 28S rRNA 和 18S rRNA 带清晰并且强度比接近 2：1（28S：18S），则表明 rRNA 是完整的。

3. 从多聚核糖体制备 RSW

(1) 如果可能的话，RSW 的制备应在冷室内进行。不必一定用新鲜制备的多聚核糖体，用冻存的多聚核糖体进行实验也是可以的。用溶液 A 重悬多聚核糖体，其浓度应大于 10⁵ 细胞/μl，比较合适的起始浓度为 2X10⁴~ 5X10⁷ 细胞/ml。

(2) 将多聚核糖体转移到含有搅拌子的实验管或烧杯中。搅拌子在使用前在 DEPC 中浸泡 3~5 min，然后用水完全漂冼净。

(3) 滴加足够的 4.0 mol/L 乙酸钾，温和搅动至其终浓度为 0.5 mol/L。

(4) 在冷室中温和搅动 15 min，避免产生气泡。

(5) 将溶液 B 加入同质异品聚合（polyallomer ) 超离心管中至其容积的 25% 左右，将盐洗的多核糖体小心地铺放在溶液 B 上，最终液面离管顶为几毫米，2℃ 130000 g 超速离心 2.5 h。

(6) 回收蔗糖溶液层上的 RSW，将盐洗的多聚核糖体沉淀保留在离心管中。

(7) 温和地充分混匀 RSW 并测定其蛋白浓度。

(8) 将 RSW 分装为 100~200 μl，储存于 -70℃。

(9) 如果需要的话，离心管底部盐洗的多聚核糖体可采用操作程序2 “从指数生长组织培养细胞制备多聚核糖体和多聚核糖体后上清S130 ”回收。

4. 内源性多聚核糖体 mRNA 的降解

(1) 将 21 μl 溶液 D 和 4 μl 多聚核糖体加入置于冰浴中的离心管内。

(2) 将管内的液体轻轻混匀并置于 37℃ 保温，注意不要振荡离心管。

(3) 温育一定时间后将反应管保存于 -70℃ 或直接提取 RNA 进行分析。如果要分析不同时间点目的 mRNA 的降解情况，应将反应管从水浴中取出后直接置于干冰上，然后可以采用任何提取 RNA 的方法，但应避免非特异的 RNase 污染。

(4) 分析并定量内源性目的 mRNA。

5. 用多聚核糖体作为 mRNase 活性源来分析外源 mRNA 的降解

(1) 取 21 μl 溶液 E 和 4 μl 多聚核糖体加入置于冰浴的离心管内。

(2) 将反应管于合适的温度下孵育一定的时间。

(3) 温育一定时间后将反应管保存于 -70℃ 或直接提取 RNA 进行分析。如果要分析不同时间点目的 mRNA 的降解情况，应将反应管从水浴中取出后直接置于干冰上，然后可以釆用任何提取 RNA 的方法，但应避免非特异的 RNase 污染。

(4) 分析并定量内源性目的 mRNA。

6. 用 RSW 作为 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解

(1) 取 20 μl 溶液 G 和 5 μl RSW 加入冰浴的离心管中。

(2) 将反应管于合适的温度下孵育一定的时间。

(3) 温育一定时间后将反应管保存于 -70°C 或直接提取 RNA 进行分析。如果要分析不同时间点目的 mRNA 的降解情况，应将反应管从水浴中取出后直接置于干冰上，然后可以采用任何提取 RNA 的方疼，但应避免非特异的 RNase 污染。

(4) 分析并定量内源性目的 mRNA。

7. 用 mRNA 依赖的兔网织红细胞翻译系统作为 mRNase 活性源分析外源 mRNA 的降解

(1) 依次在置于冰浴中的离心管内加入 35 μl 经核酸酶处理的裂解物，1 μl RNase 抑制剂、1 μl 氨基酸混合物、放射性冋位素标记的氨基酸和 mRNA 水溶液，加水至总体积为 50 μl。

(2) 轻轻混匀，并置 30℃ 反应一定的时间。

(3) 将反应产物储存于 -70℃ 或立即提取 RNA。