基本方案
实验方法原理 |
利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。适用于细菌细胞蛋白提取的方法包括超声波处理、玻璃珠研磨、钒土或石英砂研磨、French加压罐高压剪切细胞和溶菌酶处理。这些方法适用于从各种革兰阴性菌和革兰阳性菌中制备蛋白提取物。通常是使用酶的方法破坏细胞,因为细胞在悬浮液中能获得相对均一的处理。 |
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实验材料 | 表达目标重组蛋白的细菌细胞 |
试剂、试剂盒 | 二硫苏糖醇(DTT) DNaseI 1×Laemmli样品缓冲液 裂解缓冲液 |
仪器、耗材 | 离心机 |
实验步骤 |
①4℃、3000g离心15min收集细菌。 ②用裂解缓冲液洗细胞,除去残留的培养基。重复步骤①,离心收集洗过的细胞。 ③倒出上清,称沉淀的湿重。 ④每克细胞沉淀用约3ml裂解缓冲液重悬,4℃条件下搅动悬浮液30min。如果沉淀物在30min后没有完全悬浮,用韦林搅切器低速混合悬浮液1min。 ⑤加溶菌酶至终浓度1g/L,并在4℃条件下孵育35min,温和振荡。增加溶菌酶的浓度至10mg/ml,可以加速裂解。如此,在4℃条件下,5min就可以获得充分的裂解 ⑥按顺序加人如下试剂: NP-40至终浓度5g/L MgCl2至终浓度5mmol/L DNaseI至终浓度40/zg/ml 4℃搅动悬浮液30mm,除去黏性的核酸。细菌提取物包含40%〜70%蛋白、10%〜30%核酸、2%〜10%多糖和10%〜15%脂类。细胞裂解过程中DNA的释放经常导致提取物高度黏稠,这可能在接下来的层析纯化步骤中引起严重的麻烦。除了用DNaseI处理外,也可以加入带正电荷的化合物,如鱼精蛋白硫酸盐(至5mg/g沉淀湿重)或聚乙稀亚胺,通过中和溶液来除去细胞提取物中的DNA(还伴有其他核酸,在一些情况下,还有高度酸化蛋白)。 实验提示:用带正电荷的化合物除去DNA的方法不能用于包含体的提取。因为沉淀的DNA将与包含体一起被离心下来。 ⑦悬浮液在4℃条件下23000g离心30min。 ⑧用含有DTT的Laemmli缓冲液重悬一小部分沉淀。 ⑨利用分析级SDS-PAGE分析可溶性蛋白组分(上清)和沉淀组分,找出目的蛋白存在的位置。如果目的蛋白位于难溶的沉淀组分中,则可能是形成了包含体,那么目的蛋白就需要依照其他方案来溶解和纯化。若目的蛋白位于上清中,则将其贮存于4℃,以备后续纯化方案使用。
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注意事项 |
1×Laemmli样品缓冲液: 2%SDS 10%甘油 60mmol/L Tris-Cl(pH6.8) 0.01%溴酚蓝 通常把Laemmli样品缓冲液制成2×或5×的储液比较方便。在使用前,加DTT至终浓度100mmol/L。 裂解缓冲液: 50mmol/L Tris-Cl(pH7.4) 250g/L蔗糖 可以加人EDTA(至终浓度10mmol/L)螯合金属离子,以降低金属离子蛋白酶的活性。
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