本方案1
测定N-末端封闭蛋白质的内部序列
实验材料 | 蛋白质 |
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试剂、试剂盒 | 凝胶缓冲液 谷胱甘肽 疏基乙酸 考马斯亮蓝 |
仪器、耗材 | 电泳仪 微量注射器 |
实验步骤 |
1. 制备分离胶和积层胶溶液灌制变性微型凝胶。
2. 组装垂直凝胶电泳装置。
3. 将80 ml 4×凝胶缓冲液稀释至320 ml。将200 ml 1×凝胶缓冲 液倒入下层缓冲液槽。
8. 将10×上槽和下槽缓冲液稀释至1×往下槽倒入200 ml 下槽缓冲液,150 ml上槽缓冲液加入0.1 g 巯基乙酸(钠盐)后,倒入上槽。
10. 在10 mA 下电泳至粉红色的示踪染料达到凝胶的底部,关闭电源。
11. 用甲醇润湿2张PVDF膜,然后浸没在转移缓冲液中。
13. 按下面的次序在小型转移装置中组装转印夹层:塑料框、海绵、滤纸、凝胶、2张PVDF膜、滤纸、海绵、塑料框。
15. 在转移装置电极间的电压降为6 V/cm 的条件下,转移时间因目标蛋白和凝胶的浓度而异。
16. 拆卸转印装置,取出PVDF膜,将它浸没于含0.1%考马斯亮蓝的50%甲醇中,摇动 5 min。
17. 用含10%乙酸的50%甲醇脱色,摇动至条带变得清晰可见。
19. 用刀片将目标蛋內的条带切下(每条带均用新的刀片),将每一条带放入微量离心管中,室温风干(不要加热),切下的条带贮存于- 20℃
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