基本方案
实验方法原理 | 酵母细胞的裂解方法有很多种,包括自溶、压力破碎(如French加压罐)、研磨(玻璃珠振荡)和酶裂解(如Zymolase)等。本方案讨论的振荡玻璃珠研磨,是最简便的方法之一。这对于小体积(如<1mL的)和数升体积都很有效。经相差显微镜检测,细胞破碎率一般>95%。 |
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实验材料 | 新鲜培养的酵母细胞 |
试剂、试剂盒 | 裂解缓冲液(RIPA缓冲液) PBS |
仪器、耗材 | 预冷的玻璃珠 |
实验步骤 |
①在微型离心机上离心3mm,以收集细胞。 ②去上清,用PBS重悬细胞,再离心3min。 ③去上清,估算细胞沉淀的体积,向细胞沉淀中加人3倍体积的冰浴裂解缓冲 液,悬浮后置于冰上。 ④加入等体积的预冷玻璃珠。 ⑤剧烈振荡悬浮液30s。 ⑥重复步骤⑤,并在相差显微镜下观察,直到大部分酵母细胞被裂解。 ⑦4℃条件下在小型离心机中离心悬浮液5min, ⑧小心地倒出上清,并转移到另一管中,置于冰上备用。
展开 |
注意事项 |
器材预处理:将玻璃珠在1mol/L的HCl中洗两遍,然后在裂解缓冲液中洗两遍。将洗过的玻璃珠液泡于4℃条件下储存在少量的裂解缓冲液中。 |