用蛋白A/G-琼脂糖
备择 用GST融合蛋白
实验方法原理 | |
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实验材料 | 全细胞抽提物 |
试剂、试剂盒 | 抗体 免疫共沉淀缓冲液 氯化钠 蛋白 A G-琼脂糖浆 2 × 样品缓冲液(用于 SDS-PAGE 胶) |
仪器、耗材 | 20 ml 注射器和 18-G 针头 汉密尔顿注射器 |
实验步骤 | 1. 在冰上将以下组分加入离心管,双份: 0.5~1 mg 全细胞抽提物 1 μg 抗体 5 mol/L NaCl 平衡到终浓度 100 mmol/L NaCl 免疫共沉淀缓冲液到 0.5 ml 终体积 2. 轻轻翻转离心管数次,冰上孵育 90 min。中间偶尔翻转离心管。 3. 4℃ 下最大速度离心 10 min,沉淀非特异性聚集。转移上清到新的离心管中。 4. 加 50 μl 蛋白 A 或蛋白 G-琼脂糖浆(25~30 μl 珠子体积)。确保在加到样本中之前琼脂糖浆均匀悬浮。 5. 4℃ 下旋转离心管 30~60 min。 6. 4℃ 下 1000 r/min,离心 30 s,以聚集蛋白 A/G-琼脂糖。 7. 使用 1 ml 免疫共沉淀缓冲液洗沉淀 3 次。每次洗时,离心前轻轻的翻转离心管 3 次。每次离心后,使用 20 ml 注射器和 18-G 针头吸气并去除上清。 8. 最后一次尽可能在不接触珠子的情况下吸尽所有的液体并加入 25 μl 2 × 上样缓冲液。 9. 沸水煮 5 min 准备 SDS-PAGE 电泳分析,振荡器混匀,低速离心聚集珠子。使用汉密尔顿注射器加样到 SDS-聚丙烯酰胺胶上。安排两份重复样本以预备双份的免疫印迹。电泳分离。 10. 分别使用两个不同的蛋白质的抗体作免疫印迹分析。确保包含全细胞抽提物作为比较及免疫印迹的正对照(图 19.5.1)。 |